七味鐵屑方對非酒精性脂肪肝病大鼠血脂及氧化應激的影響

李 喬 尹可欣 孟 瑩 趙 聰 陳 靜 索朗平措 劉寶清

(1 北京中醫藥大學東方醫院,北京,100078; 2 北京中醫藥大學,北京,100029; 3 西藏藏醫藥大學附屬醫院,拉薩,850000)

非酒精性脂肪肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是以肝小葉為病變主體,以肝細胞脂肪變性、損傷及炎癥細胞浸潤為主要病理特征,且無過量飲酒史的臨床綜合征[1]。目前針對NAFLD的治療主要包括改善生活方式,改善代謝綜合征,修復肝損傷,減肥手術,肝移植等[2-4]。減肥和運動療法屬于基礎治療,藥物治療仍然是主要治療方式。然而,目前仍缺乏特效藥物,治療措施包括降脂、降糖、改善糖耐量、護肝、減肥藥物等為主[5-6],臨床上仍缺乏相關證據驗證其療效,且不良反應多[7-9]。中醫藥已廣泛用于NAFLD、肝纖維化的治療,與中藥復方具有多環節、多靶點減輕肝臟脂質沉積、抗炎和抗纖維化的作用相關[10]。

七味鐵屑(Qiwei Tiexie,QWTX)屬于傳統藏藥,初始載于《集藥利樂庫》中,長期用于治療各種急慢性肝病,表現出較好療效。目前針對QWTX治療NAFLD的研究提出[11],其主要是通過阻止內質網應激-脂質代謝紊亂-凋亡及炎癥通路發揮作用,進而減輕肝臟脂肪變性,改善肝臟炎癥程度。但對于治療NAFLD的具體機制及相關調控因子尚未完全明確。本實驗通過SD大鼠NAFLD模型,運用藏藥QWTX對其進行干預,觀察血脂4項及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等指標的影響,探索其對SD大鼠NAFLD脂質代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SD大鼠90只,雌性,體質量200～250 g,4周齡,購自維通利華公司,動物許可證號:SCXK(京)2012-0011,無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級動物房分籠飼養,飼養SPF級動物飼料,自由飲用無菌飲用水,環境溫度(20±2)℃,相對濕度45%～70%。動物實驗經北京中醫藥大學東方醫院實驗動物倫理委員會審批通過(倫理審批號:201627)。

1.1.2 藥物 七位鐵屑膠囊(西藏金哈達藥業有限公司,國藥準字Z20090301),由鐵屑(訶子制)、北寒水石、藏木香、木香、甘青青藍、紅花、五靈脂膏等7味藥物組成,規格:0.5 g/粒。易善復膠囊(北方安萬制藥有限公司,國藥準字H20059010),主要成分為多烯磷脂酰膽堿,規格:228 mg/粒。羧甲基纖維素鈉(Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC-Na)(上海三浦化工有限公司,批號:20160911)。

1.1.3 試劑與儀器 SOD測試盒(南京建成生物工程研究所,批號:20180712),游離脂肪酸測試盒(南京建成生物工程研究所,批號:20180726)，MDA測試盒(南京建成生物工程研究所,批號:20180706),一氧化氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20180608);蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin Staining,HE)染色劑(北京索萊寶科技有限公司，批號：20171205);倒置顯微鏡(Olympus公司,日本,型號:IX71);超薄切片機(Leica儀器有限公司,奧地利,型號:UC6);臺式高速低溫離心機(Heraeus公司,德國,型號：5427R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 90只SD雌性大鼠,適應性喂養1周后,按體質量層次隨機選取15只作為正常組,予以普通飼料喂養,余下75只以88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇的高脂飼料喂養誘導造模,并將其分為模型組,西藥組，QWTX高劑量組,QWTX中劑量組,QWTX低劑量組，每組15只。實驗期間各組大鼠自由飲水和進食,喂養持續9周。

1.2.2 給藥方法 喂養3周后,各觀察組給予相應藥物,用藥劑量按標準體質量動物劑量折算表算出:QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組分別按180 mg/(kg·d)、90 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)灌胃,易善復為123 mg/(kg·d)進行灌胃,正常組和模型組予以CMC-Na進行干預,每次灌胃量10 mL,持續6周,每周稱量體質量2次,調整相應灌胃劑量。

1.2.3 檢測指標與方法 第9周末,動物禁食水12 h后,腹腔內注射10%的水合氯醛0.30 mL/100 g予以麻醉,麻醉成功后開腹,進行下腔靜脈采血,取3 mL全血室溫靜置15 min,3 000 r/min,離心半徑10 cm,離心30 min分離血清,檢測總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、三酰甘油(Triglyceride,TG);低密度脂蛋白(Low-density Lipoprotein,LDL),高密度脂蛋白(High-density Lipoprotein,HDL);游離脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)、一氧化氮(Nitric Oxide,NO)。迅速取出肝臟并稱重,取左葉距邊緣5 mm處取1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm組織,置于40 g/L甲醛固定3 h后,梯度乙醇逐級脫水,石蠟包埋,冷凍,切片厚5 μm,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色觀察肝細胞脂肪變程度和范圍,對肝臟脂肪變性程度及炎癥反應程度進行分級、評分,NAFLD的病理組織學診斷參考2010年中國肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》。再取肝右葉,4 ℃條件下用生理鹽水制成100 g/L的肝組織勻漿,2 000 r/min,離心半徑13 cm,離心10 min后取上清液,分別采用相關試劑盒檢測SOD、MDA。

2 結果

2.1 9周各組大鼠肝臟外觀及組織病理學改變比較 正常組大鼠肝臟表面光滑,色澤鮮紅,邊緣銳利。模型組肝臟較正常組明顯腫大,成黃色,邊緣變鈍,切面油膩感;西藥組與QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組大鼠肝臟色澤淺黃,質地、體積均介于正常組與模型組之間,肉眼觀察差別不明顯。HE染色正常組大鼠肝細胞形態正常,無脂肪變形及炎癥細胞浸潤,模型組大鼠肝臟的病理形態學表現為肝細胞體積增大,胞質內可見以大泡型為主的混合型脂滴,同時肝組織可見散在炎癥細胞浸潤,未見明顯纖維結締組織增生。西藥組和QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組大鼠肝組織病變較模型組有不同程度的改善,肝細胞內脂滴減少,肝細胞脂肪變程度及炎癥細胞浸潤減輕。見圖1。

2.2 各組9周時SD大鼠血清脂類指標的變化 9周時，與模型組比較,西藥組、QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組血清TC、TG、HDL、LDL的差異有統計學意義(P<0.05),指標變化與QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組劑量存在相關性。見表1。

表1 9周各組大鼠血脂指標的變化

2.3 各組9周時SD大鼠SOD、MDA、NO、FFA比較 9周時，西藥組和QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。MDA、SOD指標變化與QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組存在劑量相關性。見表2。

表2 9周各組SD大鼠SOD、MDA(肝臟),NO、FFA(血清)

3 討論

中醫認為脂肪肝歸屬于“脅痛”“痰濁”“肝癖”等病癥范疇,而藏醫將脂肪肝即“脂肪過盛病”歸屬于“本位木布病”范疇,由于過食肥甘厚味或飲酒過度,體內三因失衡,“培根”和“赤巴”功能紊亂,其中以“培根”為主導。治療應以養血平肝、活血化瘀、清血化毒、調和三因為主。QWTX是根據傳統藏醫藥防治理論“培根捏及、赤巴覺及、龍酶年姆”而研制的藏藥復方制劑,其中鐵屑(訶子制,占97%)解肝毒、消浮腫,而訶子有降脂功效[12];紅花活血止痛[13];甘青青藍、北寒水石(奶制)解肝胃熱[14];木香、五靈脂膏行氣止痛,又配伍具有健脾和胃、調氣解郁、止痛的藏木香,達到行氣活血止痛的效果等功效。QWTX在防治脂肪肝方面有較為顯著的療效,其中包括NAFLD,但機制及其相關調控因子尚不明確。

隨著肥胖癥和糖尿病發病率的增加,NAFLD的發病率和患病率在全球范圍內呈上升趨勢[2],為普通人群的24%[15]。NAFLD的臨床表現和組織學呈多樣性,包含單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-Alcoholic Steatohepalitis,NASH)、NASH肝纖維化和NASH肝硬化和NASH相關性肝細胞癌[16],其中NASH相關性死亡率更高,成為肝移植的最主要原因[17]。NAFLD的發病機制未完全明確。目前多認為胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)引起FFA產生增多,導致肝細胞脂質過度累積,脂肪酸β氧化超載,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)大量產生,誘發氧化應激以及氧反應產物的發生,引起肝臟脂毒性;同時,脂肪變性也促進IR的發生,形成惡性循環,加重肝損傷,促進纖維化的生成[18]。

經過9周造模后觀察到大鼠肝臟外觀形態、病理組織學、血脂、FFA等指標證明大鼠NAFLD已形成。尤其模型組病理觀察到典型的脂肪變性和炎癥細胞,未見明顯纖維結締組織增生,表明該模型屬于NASH。QWTX可降低肝臟組織脂肪含量,抑制NAFLD大鼠肝臟脂質沉積,并且隨著藥物劑量的提高,作用越明顯;大鼠血清血脂較模型組有不同程度改善,差異有統計學意義(P<0.05)。通過對組方藥物的藥理研究,其中訶子的主要有效藥物成分是三萜類化合物、酚酸類[19];藏木香、木香為黃酮類、木香內酯[20-21];甘青青藍為黃酮類、三萜類化合物[22]。QWTX有效成分的藥理作用是以抗氧化、清除自由基、抑制脂質氧化應激、降脂及抗炎為主,其中三萜類化合物對阻止氧化應激發生發揮主要作用[23]。

FFA的增加被認為是NAFLD重要起始因子,過量的FFA通過誘導ROS釋放導致脂肪毒性,發生氧化應激、炎癥、細胞凋亡和肝損傷,促進肝纖維化形成[24-26]。本實驗模型組大鼠TG、TC、LDL-C和FFA含量均顯著增高,而HDL-C顯著降低,表明脂質代謝紊亂存在。QWTX能降低TG、TC、LDL-C和FFA含量,升高血清HDL-C,提示有調整脂質代謝紊亂的治療作用。MDA是脂質過氧化最重要的產物之一,其數值高低可反映脂質過氧化反應的程度[27],可以間接地反映肝臟自由基損傷的程度。SOD是人體重要的抗氧化酶,是機體內天然存在的超氧自由基清除因子,可以抑制NAFLD發病過程中的過氧化反應[28]。本實驗模型組大鼠肝臟SOD活性降低,而MDA含量增加,說明在NAFLD大鼠中抗氧化及對自由基清除能力下降,導致脂質過氧化損傷增強。QWTX可升高肝臟SOD活性,降低MDA含量,提示其通過調節自由基代謝平衡防護機體脂質過氧化。NO是在一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的作用下形成,其在NAFLD的發病過程中的作用好壞與其濃度及肝臟的微環境關系密切[29]。短暫產生少量的NO有保護肝臟細胞免受氧化損傷及代謝炎癥應激作用。長期產生大量的NO與氧自由基生成活性氮氧化合物(Reactive Nitrogen Oxide Species,RNOS)，破壞線粒體結構,啟動脂質過氧化[29-32],同時又可促進腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)的產生,加重肝損傷。本實驗模型組大鼠血清NO水平低于正常組,差異有統計學意義(P<0.01),提示NO可能抑制參與NAFLD早期發病機制的所有關鍵過程,脂肪乳劑可降低血清NO水平。QWTX與多烯磷脂酰膽堿一樣能顯著提高血清NO水平,進而與脂質過氧化物相結合,發揮抗氧化作用,減輕肝細胞的損傷和壞死程度,降低炎癥介質的水平,并改善大多數肝功能指標[33]。

綜上所述,QWTX作用于NAFLD大鼠,通過其有效藥物成分發揮作用,增強肝臟SOD活性,減少肝臟MDA含量,提高大鼠血清NO含量,有效地抑制脂質過氧化反應,從而改善脂代謝水平降低FFA,進而減輕肝損傷,延緩肝臟纖維化進程,最終發揮治療NAFLD的作用。