內質網應激在膠質瘤發生發展中的作用研究進展*

張 嬌 綜述，宋少裕，王 釗，周立宇，呂長亮，李南南，毛 輝 審校

(1.吉首大學第一附屬醫院/湘西自治州人民醫院神經外科，湖南 吉首 416000；2.湖南省湘西土家族苗族自治州鳳凰縣吉信鎮衛生院，湖南 416200)

膠質瘤是一種極具侵襲性的腦腫瘤，臨床上治療非常有限，目前的標準治療包括手術切除聯合放化療。由于無法通過手術清除所有腫瘤細胞，加上對治療的抵抗(血-腦屏障對化療藥物的阻礙)，導致膠質瘤的高復發率和低生存率，尤其是膠質母細胞瘤(GBM)的生存期僅為12～15個月，5年生存率不足5%。與正常細胞相比，癌細胞為了激活致瘤信號通路及對抗宿主的腫瘤抑制機制，會增加蛋白質合成并進行一些代謝修飾，這種合成活動大部分發生在內質網中。然而，腫瘤細胞不斷暴露于細胞內DNA損傷和修復應激，以及其他細胞外損傷，因此加大了出現蛋白質錯誤折疊和蛋白質穩態紊亂的風險。

1 內質網應激(ERS)概述

內質網是真核細胞內分泌途徑的重要場所，負責脂類和蛋白質合成及鈣離子依賴信號轉導，正常生理情況下正確折疊的蛋白質被轉運到指定部位發揮作用。內質網的正常功能可被各種病理和生理刺激所破壞，當細胞處于缺氧、低葡萄糖、氨基酸饑餓、生長因子缺乏、乳酸中毒、氧化應激和病毒感染等環境時，蛋白質翻譯和分泌增加，促進內質網中錯誤折疊蛋白的積累，從而導致ERS的發生，激活非折疊蛋白反應(UPR)[1]。UPR不斷監視著內質網內蛋白質的折疊情況，必要時啟動反作用措施以維持內質網穩態。當細胞處于一定的ERS狀態下，穩態的UPR不僅通過減少合成新蛋白質和增加蛋白質折疊來應對應激，還可以通過ERS使相關蛋白降解或自噬來減少錯誤折疊蛋白的積累，從而降低蛋白質的毒性。然而，當過度應激超過UPR的監控能力時，受損細胞通過激活UPR啟動細胞凋亡程序[2-3]。

UPR由3個內質網跨膜蛋白：RNA依賴蛋白酶樣內質網激酶(PERK)、肌醇需求酶α1(IRElα)、和活化轉錄因子6(ATF6))觸發的不同信號通路組成(包括PERK-eIF2α-ATF4，IRE1α-XBP1和ATF6通路)。伴侶蛋白重鏈結合蛋白(BiP)/GRP78位于內質網腔內，是ERS的中樞傳感器。在生理條件下BiP/GRP78與3個傳感器PERK、IRE1、ATF6處于結合失活狀態，發生ERS時，BiP/GRP78從3個跨膜蛋白組成的復合物中釋放，隨后激活相應的UPR通路以恢復內質網穩態[4]。這是通過抑制蛋白合成，胞質中的蛋白酶體刺激內質網相關蛋白降解(ERAD)，以及上調伴侶蛋白和折疊酶的表達來實現的。當細胞無法應對ERS時，就會激活轉錄因子乙酰膽堿脂酶同源蛋白(C/EBP-CHOP)來誘發凋亡[5-6]。

2 ERS的信號通路

2.1PERK信號通路 PERK是一種跨膜蛋白，具有N端應激敏感結構域和胞質激活結構域。PERK的主要底物是真核生物翻譯啟動因子2α(eIF2α)。在ERS時，磷酸化的eIF2α阻止eIF2-GTP-Met-tRNA三元復合物的結合而抑制mRNA的翻譯，此外，PERK和BiP分離使PERK自磷酸化，從而導致eIF2α磷酸化來抑制蛋白質的翻譯，XBP1使蛋白合成被抑制，從而阻止ERS中錯誤折疊蛋白的進一步積累。同時反常地增加了一些在5′端上游開放閱讀框mRNA的翻譯，如ATF4。ATF4是一種轉錄因子，可介導蛋白質折疊、氧化應激、自噬和氨基酸代謝。然而，如果ERS仍未解決，持續的PERK激活將導致C/EBP-CHOP轉錄因子上調，并增加Bcl-2家族蛋白的表達，促進細胞凋亡[7-8]。

2.2IRE1信號通路 IRE1是真核細胞中一種保守的跨膜蛋白，在ERS中起重要作用。正常情況下，IRE1與內質網膜上的GRP78結合，當ERS發生時，IRE1通過自磷酸化被激活，表現出核糖核酸內切酶活性，切除IRFE1信號通路下游分子(XBP1)堿基，生成活性剪接體(XBP1s)，調控ERAD活性基因的激活、蛋白質折疊和內質網膜擴張[9]。IRE1還被發現通過招募腫瘤壞死因子受體相關因子2 (TRAF2) 激活JUN N端激酶(JNK)， JNK磷酸化并抑制Bcl-2、Bcl-xL的抗凋亡活性，或激活BIM、BID的促凋亡功能來啟動細胞凋亡途徑[10]。

2.3ATF6信號通路 ATF6是一種跨膜轉錄蛋白，具有2種亞型：ATF6α和ATF6β。但ATF6被激活時，ATF6α移位到高爾基體被當地的蛋白S1P和S2P切割，生成細胞質片段ATF6f 遷移至細胞核以調節基因轉錄，促進ERAD和XBP1基因的轉錄[11]。UPR還與自噬相關，自噬是細胞分解代謝的一個主要過程，其將大量蛋白質聚集物和受損的細胞器隔離，并在自噬小體中降解，自噬作為另一種EDRA機制，與3個UPR信號通路緊密相關[12]。

3 ERS在膠質瘤中的作用

3.1膠質瘤中的PERK信號 當膠質瘤細胞處于缺氧或葡萄糖缺乏時PERK表達增加。腫瘤細胞處于缺氧的微環境時，通常傾向于糖酵解而不是氧化磷酸化作為其主要的能量產生途徑。糖酵解的第一個關鍵酶——己糖激酶II (HK2)在膠質瘤中大量表達，功能依賴于Akt的激活，允許HK2轉運到線粒體外膜，并誘導從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉變。有研究表明，Akt的磷酸化可以通過PERK的激活來調節。沉默的PERK可以通過阻斷Akt和HK2線粒體轉位降低低糖應激條件下ATP和乳酸的產生，從而增加膠質瘤細胞的死亡[13]，強調了PERK在腫瘤形成中的必要性。內質網伴侶蛋白BiP/GRP78和ATF4在GBM細胞系中的表達水平與增殖率呈正相關，研究表明GBM患者和U87來源的小鼠異種移植中BiP/GRP78和UPR轉錄因子水平均升高，特別是PERK通路最活躍，膠質瘤細胞中PERK的沉默抑制了腫瘤的進展[14]。膠質瘤細胞通過上皮-間充質轉化(EMT)獲得轉移潛能，增強細胞運動性和細胞死亡抗性。EMT細胞通過上調基質金屬蛋白酶2(MMP2)和MMP7，有規律地激活UPR的PERK通路，此外，其還增強了轉移相關溶酶體相關膜糖蛋白3 (LAMP3)基因的表達，促進癌細胞中絲狀偽足的形成，并誘導細胞黏附，這是腫瘤細胞外滲和膠質瘤整體進展所必需的[15]。

3.2膠質瘤中的IRE1信號 研究表明，IRE1可以改變內質網到核信號1(ERN1)的特性，并可能參與腫瘤發生，IRE1/XBP1軸可降低成熟細胞對低氧誘導死亡的敏感性[4]。IRE1信號通路還通過激活B細胞的核因子κB(NF-κB)光鏈增強子及調節白細胞介素-6 (IL-6)和IL-1β的分泌，參與促腫瘤性炎癥，從而在炎癥相關的膠質瘤發生中發揮重要作用。研究證明，IRE1信號在腫瘤侵襲性中起到重要作用，ERN1基因的P336 L突變在膠質瘤中最常見。當腫瘤細胞受到缺氧等外源性應激時，ERS傳感器IRE1激活并上調血管內皮生長因子-A(VEGF-A)，而缺少IRE1基因的腫瘤細胞無法誘導VEGF-A表達，并且在體內缺乏足夠的腫瘤生長和新血管生成[16]。IRE1低表達的膠質瘤小鼠中，腫瘤新生血管和血液供應減少，生長速度下降，存活率增加[17]。另外，IRE1被證明能促進正常上皮細胞的遷移，提示其可能在腫瘤轉移中起作用，XBP1信號通路可促進免疫細胞的生長和腫瘤浸潤，并增加腫瘤侵襲標志物的表達[18]。這一證據表明，IRE1依賴的信號在腫瘤發展中發揮關鍵作用，有利于膠質瘤細胞增殖和轉移。

3.3膠質瘤中的ATF6信號 研究還表明，ATF6可被VEGF激活，提高內皮細胞的存活率，有助于腫瘤微環境的形成[19]。在膠質瘤中已經觀察到磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/雷帕霉素復合物1 (PI3K/Akt/ mTOR)通路的激活，可進一步增加VEGF分泌，VEGF隨后通過磷酸肌苷磷脂酶Cγ (PLCγ)介導干擾mTORC1復合物[20]，激活UPR的ATF6和PERK分支。另一方面，ATF6下調可抑制VEGF誘導的血管生成[20]，提示UPR與VEGF信號通路在調控血管生成和塑造腫瘤微環境中有重要作用。

4 ERS為膠質瘤治療提供可能靶點

UPR治療GBM可以從以下2點進行干預。一方面，可以將應激增加到某一臨界點，超出內質網穩態的維持能力，從而導致腫瘤細胞凋亡；另一方面，利用藥物通過抑制UPR反應的3條通路之一來殺死癌細胞，阻止ERS的促腫瘤細胞生長功能。

4.1UPR傳導信號誘導劑 誘導UPR信號傳導的藥物可分為一般UPR激活劑和選擇性GRP78、ATF6和PERK誘導劑。一般UPR激活劑可以激活UPR的所有通路。

三角胍型倍半萜類自由基(RAD)通過誘導PERK、IRE1和ATF6信號通路的激活，上調UPR。經過RAD的處理可導致eIF2α磷酸化增加，以及激活CHOP和ATF4表達，活化eIF2α-ATF4-CHOP通路導致細胞凋亡[21]，提示RAD通過ERS依賴通路誘導細胞凋亡。經選擇性5 -羥色胺再攝取抑制劑氟西汀(FLT)處理后的大鼠膠質瘤C6細胞株，FLT激活CHOP及其下游效應基因GADD34，增強了PERK和eIF2α的自動磷酸化，激活PERK-eIF2α-ATF4和ATF6級聯反應，降低了膠質瘤細胞增殖，促進了細胞凋亡。同時FLT與替莫唑胺(TMZ)聯合可協同作用于膠質瘤細胞，是目前膠質瘤化療的“金標準”[22]。吉非替尼誘導膠質瘤凋亡與GRP78、ATF4和CHOP蛋白表達升高，PERK、eIF2α與IRE1蛋白磷酸化，ATF6蛋白水解呈正相關，這些分子是ERS的重要標志[23]。

最近的研究發現，蟾毒毒素中存在的蟾硫酮通過ERS誘導效應導致U87和U373 膠質瘤細胞系凋亡，與TMZ共同作用于膠質瘤細胞系，對腫瘤生長具有協同作用[24]。

有研究用抗表面定位GRP78的多克隆N-20抗體處理異種移植GBM小鼠的GBM細胞株，發現N-20抗體可通過抑制表面GRP78的功能來抑制癌細胞的存活和生長[25]。

GRP78和GPRP94等蛋白的過表達可提高膠質瘤干細胞(GSCs)的抗輻射能力，用ERS誘導藥物2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)照射GSCs，通過CHOP誘導凋亡進一步下調GSCs的活性，發現其活性呈劑量依賴性[27]。

在ERS下，誘導ATF6的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子釋放到細胞質中，然后釋放到細胞核中，其通過促進ATF6調控基因的轉錄發揮作用。小分子蛋白穩定調節因子147和263通過與調控蛋白[包括BiP和蛋白二硫化物異構酶I (PDI)]相互作用間接增強ATF6的激活，這些調控蛋白能夠啟動ATF6向高爾基體的易位。另一方面，像147和263這樣的化合物可能通過靶向或模仿參與ATF6通路激活的其他分子來誘導ATF6活性[28]。

使用eIF4E/eIF4G相互作用抑制劑1 (4EGI-1)可誘導PERK磷酸化和XBP1 mRNA的表達，且呈劑量依賴性。還觀察到內質網管腔的形態學改變、內質網鈣離子釋放增加和CHOP蛋白上調，提示4EGI-1的抗癌作用與ERS誘導的細胞凋亡有關[29]。

4.2UPR抑制劑 一些化合物在體外和體內膠質瘤模型中均表現出選擇性抑制UPR的作用，從而調節其轉化。小分子16F16是一種ATF6抑制劑，通過阻斷其靶點PDIA、16F16使細胞無法從應激的內質網輸出ATF6， UPR不能對高ERS做出反應[30]。

最近有實驗發現，SCD1抑制劑CAY可引起IRE1信號介導的細胞凋亡，經CAY治療異種移植小鼠模型的存活率增加， SCD1也被發現在ERS時期上調，以幫助緩解ERS并保護細胞免受凋亡[31]。GSK2656157是PERK磷酸化抑制劑相關藥物，在膠質瘤在內的多種腫瘤中均表現出抗血管生成和抗腫瘤作用[32]。

4.3作用于蛋白質生成的小分子干擾劑 JLK1486是一種新的ERS誘導劑，可干擾蛋白質折疊所需的二硫鍵形成，導致蛋白質錯誤折疊的積累，增加ERS并激活UPR。在缺氧、營養缺乏和低pH的環境中，伴隨著UPR激活的持續，其會導致促凋亡轉錄因子、ATF4和CHOP的上調，升高BiP/GRP78水平。因此，通過JLK1486進一步增加ERS不利于腫瘤細胞的生存[33]。N-連接糖基化(NLG)抑制劑，如衣霉素(TUN)，在U251人膠質瘤細胞中，通過抑制表皮生長因子(EGFR)的糖基化，從而使膠質瘤細胞對輻射敏感[17]。NLG抑制劑已在D54和U87MG膠質瘤異種移植瘤模型中得到進一步驗證。

BFA是由一種青霉菌產生的高爾基體干擾物，已經被證明會干擾高爾基體內的蛋白質成熟，從而捕獲異常蛋白并誘導ERS，BFA通過降低膜型基質金屬蛋白酶(MT1-MMP)的表達來降低膠質瘤的侵襲和轉移潛能[34]。

蛋白酶體抑制劑(PI)可引起異常蛋白的積累和ERS的升高，在體外膠質瘤中表現出細胞抑制和細胞毒性作用[35]。有報道稱，PI奈非那韋和阿塔贊韋通過蛋白酶體抑制和上調控制UPR的關鍵分子來誘導UPR，奈非那韋與腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)聯合使用，可進一步激活膠質瘤的UPR和凋亡[36]。

4.4引起鈣離子耗竭因子 有證據表明，內質網鈣離子耗竭的延長通過干擾伴侶蛋白的功能和蛋白質的成核而引起蛋白質的展開。因此，黃酮類化合物、內質網鈣離子 ATP酶(SERCA)抑制劑、鹽霉素等鈣離子耗竭因子可能能夠增加UPR反應，導致其促凋亡途徑的激活[36]。

5 小結與展望

UPR是一種信號轉導途徑，當細胞無法維持內質網內蛋白質穩定時被激活，為了緩解內質網腔內錯誤折疊蛋白的堆積，UPR啟動自適應輸出，減少蛋白質折疊負荷，增加內質網分泌通路恢復穩態的能力。然而，當這種糾正措施不能恢復內質網內蛋白質穩態時，UPR會促發死亡信號的產生，導致細胞凋亡。膠質瘤癌細胞內存在許多威脅蛋白質穩態的因素(缺氧、營養剝奪、蛋白酶體功能障礙、分泌途徑需求增加及客戶蛋白的體細胞突變)，往往導致UPR過度激活。目前，關于UPR誘導細胞死亡的研究揭示了一些可以用來操縱ERS反應的未知機制，用其來對抗膠質瘤細胞。這一發現為膠質瘤的治療開啟了新的篇章，使用UPR調控藥物作為單一療法或與化療和放療聯合使用，提高腫瘤對當前治療的敏感性，有可能延長膠質瘤患者的預期壽命。但是，因為目前的研究大多數都是基于體外和臨床前研究，未來的研究還需要在體內或臨床環境中測試不同藥物的作用，以更好地評估UPR的靶向效應。總之，仍需要廣泛的研究來深入了解UPR的生理學及在中樞神經系統病理學中的作用，以克服UPR靶向藥物的局限性和不良反應。