基于SERS的過氧化氫檢測法及在發酵液中甘油含量監測中的應用

張法楠， 劉傳志， 李柏志， 李鴻睿， 侯 玥

(1. 長春理工大學 生命科學技術學院， 長春 130022； 2. 吉林大學 藥學院， 長春 130021)

過氧化氫(H2O2)是需氧生物中常見的天然代謝產物[1], 該化合物一直被認為是氧化代謝的有害副產物[2]. 近年來， H2O2和相關活性氧(reactive oxygen species， ROS)參與動、 植物生理功能的研究受到人們廣泛關注[1]. H2O2還在許多(病理)生理條件下產生自由基ROS， 并參與體內氧化還原過程的調節[3]. 目前， H2O2的研究涉及許多生物過程的前沿， 如細胞增殖和分化、 組織修復、 炎癥、 晝夜節律的中心氧化還原信號傳導分子和老化[4]等.

對H2O2代謝和信號傳導的觀察， 要求具有高靈敏的可靠測量[5]， 但目前測定H2O2的方法均非常耗時[6-7]. 比色試劑盒法用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)催化H2O2， 以3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine， TMB)為底物改變吸光度值定量H2O2[8]. 雖然HRP具有高度的特異性， 但檢測的靈敏度仍不能滿足需要.

畢赤酵母是一種廣泛使用的重組蛋白生產宿主， 畢赤酵母前期以甘油為碳源， 當畢赤酵母生長達到預定指標時， 可將甘油耗盡， 便進入以甲酵作為唯一碳源的蛋白表達階段. 因此， 實驗中及時掌握甘油耗盡點， 可為添加甲醇進行蛋白表達提供準確信息[9-12]. 目前的甘油檢測方法是將甘油-3-磷酸氧化酶(glycerol 3-phosphate oxidase, GPO)等物質的量氧化成甘油-3-磷酸和H2O2， 再利用HRP將 H2O2分解成H2O和O-， 導致色原氧化變色， 通過顏色變化計算H2O2濃度.

表面增強Raman光譜(surface-enhanced Raman scattering， SERS)廣泛應用于超靈敏的生物測定平臺, 如測量微生物、 特異性抗體、 適體、 肽和核酸等[13-20]. Li等[21]研究了SERS基于Au 納米粒子及靶向肽的修飾探針， 該探針創建了一個金-硒界面， 與線粒體中H2O2反應并定位, 該探針在生物條件下對豐富的硫醇表現出良好的耐受性， 并且在活細胞中監測線粒體 H2O2的性能優越， 實現線粒體 H2O2的原位定量， 并獲得其真實的氧化應激下時間動態變化； Jiang等[22]研究了一種基于沸石咪唑酯骨架-8(ZIF-8) 的SERS傳感器， 通過將ZIF-8與活性金納米粒子(AuNPs)結合作為響應探針， 檢測活細胞釋放的H2O2， 由于SERS優越的指紋識別和ZIF對H2O2的高效富集和選擇性響應， 該方法對H2O2檢測表現出較高的抗干擾能力， 檢測限低至0.357 nmol/L， 由于AuNPs和ZIF的成功整合提高了催化活性， 響應時間可縮短至1 min， 證明了SERS傳感器在快速檢測H2O2方面的有效性； Cheng等[23]構建了一種新型硼酸(BA)納米探針對H2O2含量進行定量表征， 其中將金納米棒修飾的對硫醇苯硼酸(4-MPBA)報告分子(AuNRs)用于Raman信號增強. 結果表明， 合成的AuNRs/4-MPBA/BA 納米探針在H2O2含量的測量靈敏度方面具有明顯優勢, 對應的線性范圍和檢出限為分別為0.5～2×103μmol/L和0.15 μmol/L, 回收率和相對標準偏差分別約為96%和6%.

TMB底物氧化可產生具有強烈SERS活性的產物TMB2+. HRP催化H2O2的反應中， 可將SERS惰性的發色反應物TMB氧化成SERS活性產物TMB2+. TMB2+的SERS信號隨H2O2濃度增加在一定范圍內呈線性增加[24]. 本文利用納米金(AuNP)可增強Raman信號的特征[25]， 通過將納米金粒子(AuNP， 60 nm)水溶液引入樣品中， 使用SERS方法定量檢測不同濃度的H2O2， 根據文獻[24]確定在1 338,1 605 cm-1處的Raman峰是TMB2+的SERS特征峰. 采用SERS基于HRP催化H2O2氧化TMB的反應及AuNP的Raman增強信號作用， 實現H2O2的微量定量分析. 根據酵母發酵中甘油可等物質的量氧化成甘油酸和H2O2的原理， 通過檢測H2O2濃度對酵母培養液中甘油濃度的微量變化進行了定量分析， 并與商品試劑進行比較. 結果表明， 甘油檢出限LOD=2.75 μmol/L, 酵母培養液中甘油消耗的速度與酵母增值呈正相關. 微量的甘油分析可及時掌握甘油耗盡點， 提高了檢測即時甘油的靈敏度和效率， 為蛋白誘導表達提供準確信息.

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

IX71型Raman顯微鏡(RM， 日本OLYMPUS公司)； ONLAB-EU2000型分光光度計(上海昂拉儀器有限公司)； ISO Planesct 320型激光發生器和冷卻電荷耦合器(-70 ℃， 瑞典Cobolt公司， 功率30 mW)； Tecnai G2 Spirt Biotwin型透射電子顯微鏡(美國FEI公司)； bioflo 310型發酵罐(7.5 L, 美國NBS公司). 3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB, 上海滬試化工公司)； 辣根過氧化物酶(HRP, 日本TOYOBO公司)； 納米金(AuNP， 60 nm, 蘇州桓球科技公司)； 畢赤酵母(吉林大學藥學院現代生物學教研室)； 甘油檢測試劑盒(愛爾蘭Megazyme公司)； 甘油-3-磷酸氧化酶(GPO， 美國Sigma公司)； TMB儲存液(湖州英創生物科技有限公司);φ=30%的H2O2、 檸檬酸和磷酸氫二鈉(上海滬試化工公司)； 0.5 mol/L H2SO4和10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(廈門英科新創科技有限公司); 其他試劑均為國產分析純試劑.

上罐種子培養液組成： YPD培養基， 每升培養液中含φ=0.5%的甘油，φ=2%的胰化蛋白胨，φ=1%的酵母提取物. 上罐發酵培養液組成：φ=85%的H3PO46.67 mL, CaSO4·2H2O 0.23 g, K2SO44.55 g, MgSO4·7H2O 3.72 g, KOH 1.03 g, 甘油 10 g, 加入雙蒸餾水至1 L， 高壓滅菌. 實驗用水均為雙蒸餾水.

1.2 H2O2檢測方法建立及應用

1.2.1 H2O2標準液制備

委托吉林省正恒檢測有限公司， 先將φ=30% H2O2用高錳酸鉀標定， 再稀釋成濃度為88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L的溶液， 2～8 ℃儲存備用.

1.2.2 TMB顯色液配制

取25 mmol/L TMB儲存液0.125 mL， 0.1 mol/L檸檬酸2.5 mL， 0.2 mol/L磷酸氫二鈉2.5 mL， 雙蒸水5 mL， 混合， 于2～8 ℃避光儲存備用.

1.2.3 過氧化物酶(HRP)試劑配制

用pH=7.4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液將HRP配制成100 U/L的溶液(其中U定義為每分鐘轉化1 μmol底物需要的酶量)， 于2～8 ℃保存備用.

1.2.4 H2O2的ELISA檢測法

分別取88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L H2O2各200 μL， 然后加入TMB顯色液50 μL， 100 U/L HRP 20 μL， 于37 ℃反應20 min， 各孔加入0.5 mol/L H2SO450 μL. 用分光光度計于400～600 nm分別掃描測量各濃度H2O2的吸光度(Abs)值.

1.2.5 H2O2的SERS檢測方法建立

分別取88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L H2O2各200 μL， 然后加入TMB顯色液50 μL， 100 U/L的HRP 20 μL， 于37 ℃反應20 min， 各孔加入0.5 mol/L H2SO450 μL和AuNP(60 nm)50 μL.

在H2O2測量過程中， 分別對H2O2+TMB+HRP， H2O2+TMB+HRP+H2SO4和H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP在波長1 300～1 800 cm-1內進行SERS掃描. 同時采用透射電子顯微鏡對AuNP的均一程度進行觀察.

檢測在反射模式下進行， 使用633 nm激發激光(激光功率為5%)， 1 800線/mm光柵和冷卻的電荷耦合器件(-70 ℃). 10倍物鏡發出激光束并收集反向散射光， 以5 s的積分時間進行測量. 在每個SERS區域的10個位置進行測量， 并對數據取平均值. 使用WiRE 3.2(雷尼紹軟件)進行背景校正和曲線擬合. 在進行曲線擬合前， 先通過六階多項式擬合將光譜減去背景.

將濃度為88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L 的H2O2標準液分別加入TMB，HRP，H2SO4和AuNP中， 在波長1 300～1 800 cm-1內進行SERS掃描檢測， 每個樣品分別檢測10次， 數據經SPSS 19.0統計軟件分析. 根據實驗數據計算SERS檢測方法的重復性(CV)； 根據不同濃度H2O2的Raman信號強度確定該方法的檢測限(LOD)及線性范圍； 將2.75，5.5 μmol/L的H2O2進行加標， 使其理論背景值分別達到5.5，11.0 μmol/L， 進行加標回收率(%)實驗.

1.2.6 發酵液中甘油的SERS定量分析

實驗采用SERS檢測方法對不同發酵時間發酵液中甘油濃度的變化進行定量分析. 采用7.5 L發酵罐, 酵母上罐前進行滅菌， 冷卻至30 ℃時在上罐發酵培養液中按5%的體積分數投入菌液， 轉速600 r/min， 通氣量10 L/min， 調節pH=5.5, 培養12 h. 分別在0，6，12 h取樣檢測甘油濃度, 觀察氧溶(dissolved oxygen， DO)值和OD600值變化. SERS檢測樣品中GPO和 HRP分別為1.0，10 U/mg.

1.2.7 發酵液中SERS分析H2O2的干擾實驗

酵母發酵培養液由5.67 g H3PO4, 0.23 g CaSO4·2H2O, 4.55 g K2SO4, 3.72 g MgSO4·7H2O, 1.03 g KOH和10 g甘油組成. 預先將培養液制備成原液、 體積比為1∶1和1∶2的溶液， 采用SERS檢測方法對3種不同濃度培養液中的H2O2進行平行3次檢測. 觀察在培養液中各物質變化對H2O2檢測的影響.

2 結果與討論

2.1 H2O2的比色檢測(ELISA法)

在H2O2存在的情況下, HRP可將無色的底物分子TMB氧化成藍色氧化物TMB2+(圖1(A)). 加入強無機酸(如H2SO4)可終止反應， 產生黃色的TMB2+(圖1(B))， 可見低pH值條件有利于形成雙電子產物. 通過分光光度計對電荷轉移復合物和TMB2+進行定量可得到一種方便的檢測方法. 圖2為TMB2+的氧化產物在不同濃度H2O2中的顯色效果. 圖3為不同濃度H2O2檢測的線性關系. 由圖3可見， 隨著H2O2濃度的降低， 450 nm處的吸光度降低， 檢出限LOD=5.5 μmol/L.

圖1 TMB氧化反應原理(A)和TMB氧化后的顏色變化(B)

圖2 不同濃度H2O2顯色的可見光譜分析

圖3 不同濃度H2O2檢測的線性關系

2.2 H2O2的SERS光譜分析

SERS檢測中常采用金或銀納米顆粒作為Raman信號增強子. 金屬納米顆粒可導致平均光散射增強104～106倍[25-26]. 這種增強的電磁場由納米粒子表面電子激發所致， 被稱為局部表面等離振子共振(LSPR). LSPR是由納米粒子的電子響應于入射光的振蕩導致電子波共振狀態. LSPR在LSPR峰值的波長處產生強烈的納米粒子吸收和散射， 可提高SERS測定的靈敏度[27-28].

AuNP和納米銀(AgNP)均具有較強的Raman信號增強作用. 由于氧化還原反應易導致AgNP氧化， 其穩定性較差， 因此本文選擇AuNP作為Raman信號增強子. 由于不同AuNP尺寸的增強作用、 粒子的均勻程度間存在差異， 經實驗對比后， 采用蘇州桓球科技公司生產的60 nm AuNP作為Raman信號增強子， 電鏡照片如圖4所示.

圖4 60 nm AgNP電鏡照片

分別將AuNP，H2O2+TMB+HRP，H2O2+TMB+HRP+H2SO4和H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP進行分組檢測， 在波長1 300～1 800 cm-1內進行SERS掃描， 結果如圖5所示. 各組中只有H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP組在1 605 cm-1具有Raman強度信號改變， 顯示其特異性峰值.

圖5 過氧化物酶催化H2O2至TMB氧化反應的SERS光譜

2.3 H2O2的SERS定量分析

分別向濃度為88，44，22，11，5.5，2.75,1.37 μmol/L 的H2O2標準液中加入TMB，HRP，H2SO4和AuNP， 在波長1 300～1 800 cm-1內進行SERS掃描檢測， 每個樣品分別檢測10次， 取平均值， 結果如圖6所示. 由圖6可見， 隨著H2O2濃度的降低， 1 605 cm-1處的Raman強度逐漸降低. 因為H2O2濃度為1.37 μmol/L時Raman信號重復檢測中具有較大差異， 所以將檢出限確定為LOD=2.75 μmol/L. 當H2O2濃度為2.75～22 μmol/L時， 其與Raman信號強度的自然對數具有線性關系，R2=0.995， 檢測的線性曲線如圖7所示.

圖6 不同濃度H2O2的SERS定量分析

圖7 不同濃度的H2O2與Raman強度自然對數的線性關系

SERS定量分析H2O2數據經SPSS 19.0統計軟件分析， 其平均CV=5.38%， 平均回收率=96.05%， 結果列于表1. 實驗表明， SERS方法比ELISA方法檢測H2O2濃度的LOD值降低一倍， 且靈敏度更高[29-31].

表1 SERS定量分析H2O2濃度的精密度(n=10)

2.4 發酵液中甘油的SERS 定量分析

實驗利用酵母發酵液中甘油在GPO和HRP的作用下等物質的量氧化成甘油酸和H2O2的原理， 通過檢測H2O2濃度， 對酵母培養液中甘油濃度的微量變化進行定量分析. 實驗采用SERS檢測H2O2的方法對0，6，12 h培養液中的甘油濃度進行測量， 同時對比培養期間的DO和OD600值. 結果如圖8所示. 由圖8可見： 隨著培養時間的增加， 酵母持續繁殖， 甘油逐漸耗盡， OD600值增高； DO值在對數生長期下降明顯， 至對數生長期末期出現最低值， 而在發酵后期， 由于菌體衰老， 呼吸強度減弱， 因此DO值逐漸上升， 符合酵母培養的生長規律. 表明SERS檢測甘油的方法可在酵母培養過程中快速、 準確監測培養液中甘油的消耗情況.

圖8 不同發酵時間發酵液中甘油濃度的SERS定量分析(A)， DO值(B)和OD600值(C)變化

2.5 發酵液中SERS法檢測H2O2的干擾實驗

因酵母的生長需求， 通常酵母培養液中會含有多種無機鹽和甘油. 實驗通過在不同濃度培養液中添加5.5，11.0 μmol/L H2O2， 觀察培養液成分變化對甘油檢測的干擾程度， 結果列于表2. 由表2可見， 不同濃度培養液中的各種無機鹽和甘油濃度變化對檢測無明顯干擾作用.

表2 不同濃度培養液中H2O2的SERS檢測結果(n=3)

綜上所述， 本文設計了一種H2O2定量分析方法. 通過利用過氧化物酶活性， 在H2O2存在下催化底物TMB的反應， 生成最終產物TMB2+， 在Raman增強分子AuNP的共同作用下， 獲得較敏感的SERS信號， 實現了H2O2定量分析. 實驗觀察到TMB2+的SERS檢測信號的自然對數， 在H2O2濃度為2.75～22 μmol/L內呈線性增加， 檢出限LOD=2.75 μmol/L，R2=0.995， 平均CV=5.38%， 平均回收率為96.05%. 通過對發酵液中甘油的SERS定量分析， 表明該方法具有較高的靈敏度、 精密度和準確性， 在較短時間內實現了對H2O2的定量分析.