自噬及相關信號通路在脊髓損傷中的作用機制研究進展

李志超李念虎薛海鵬陳仁場高 尚

(1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院,濟南 250014;2.山東中醫藥大學附屬醫院,濟南 250014)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)通常會導致大范圍的感覺運動神經和自主神經損傷。據美國SCI統計中心統計,僅美國每年新增病例約17000例,治療的年平均費用高達676000美元,是世界范圍內一個嚴重的公共衛生問題[1]。SCI的病理過程包括最初的機械性損傷和隨后的繼發性損傷,繼發性損傷期會持續加重SCI程度,因此該階段也是SCI治療的關鍵時期。考慮到神經元細胞死亡作為此時期關鍵的病變機制,是造成神經功能障礙的主要原因,而自噬性細胞死亡為神經細胞死亡的主要方式之一,所以深入研究涉及細胞自噬的調節機制對開發新的有效治療方法至關重要[2]。信號通路即細胞信號的傳導途徑,在SCI病程中,多種因素可通過相關信號通路來影響自噬,而合理調節自噬被認為會對受損神經組織起到重要保護作用[3]。基于此,本文對自噬與SCI的聯系以及自噬相關信號通路調控自噬流干預SCI的作用機制進行綜述,以期為SCI的治療尋找新的突破口。

1 細胞自噬在脊髓損傷中的作用

自噬是一個重要的細胞內降解過程,自噬體將受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質和細胞內的病原體包裹,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,將包裹的內容物降解回收并重新用于細胞能量和功能,這一動態循環過程被稱為自噬流,在維持細胞內穩態中發揮重要作用。自噬標志物微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3(LC3)、beclin-1蛋白及p62蛋白反映了自噬流的水平。在自噬過程中,LC3從其胞質形式 (LC3Ⅰ)轉化為LC3Ⅱ形式,參與自噬體膜的形成;beclin-1則被Unc-51樣自噬激活激酶-1(ULK1)磷酸化,作為磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)復合物的整體支架,促進自噬蛋白定位到自噬泡;自噬適配器sequestosome-1(p62)作為自噬降解底物的受體,一同在自噬溶酶體內降解。LC3Ⅱ、beclin-1水平升高及p62水平降低,表示自噬流被激活,相反則表示自噬流受阻[4]。在SCI發生后,由于受損的細胞器和蛋白在神經元中不斷積累,因此許多學者認為激活自噬將有利于SCI繼發性損傷期的恢復[5]。然而,自噬不僅參與細胞合成和降解之間的平衡,在部分研究中,激活的自噬不僅沒有起到細胞保護作用,反而可能因過度激活自噬導致過度自我消化從而造成細胞程序性死亡,即自噬性細胞死亡[6]。因此探究SCI后神經細胞自噬機制,有效利用自噬規律,從而合理調節自噬流,將成為SCI研究的重點方向。目前,基于各種自噬相關信號通路的研究正在試圖闡述激活或抑制自噬對SCI恢復造成的影響,但結果往往存在爭議,可能與SCI的位置和程度、激活自噬的程度、急性還是慢性的操控、持續時間、是否只是單獨激活自噬等因素相關[7]。但不可否認的是,通過某些自噬相關的信號通路調節自噬流,確可起到對損傷神經的保護作用,改善損傷后的脊髓功能。

2 各信號通路在脊髓損傷自噬中的聯系

2.1 PI3K/Akt/mTOR信號通路

PI3K/Akt/mTOR信號通路被認為是SCI中參與自噬的核心信號通路[8]。PI3K分為3種亞型,即Ⅰ～Ⅲ型。PI3K-Ⅰ型由調節亞基p85和催化亞基p110構成二聚體,受各種生長因子和相關受體蛋白的配體所激活。PI3K催化磷脂酰肌醇二磷酸生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),PIP3與含有PH結構域的蛋白Akt和PDK1結合,調節PDK1以激活Akt。活化的Akt則會進一步激活下游的靶蛋白mTOR。mTOR由兩個不同核心蛋白質復合物組成,即mTOR復合物1(mTORC1)和mTORC2,mTORC1能被磷酸化的Akt激活。mTORC1的激活將抑制細胞自噬,發揮負向調節自噬過程的作用。

目前,很多研究通過PI3K/Akt/mTOR信號通路雙向調節自噬,以達到減少SCI后體內細胞凋亡并誘導運動恢復的目的[9]。相關研究發現,在SCI后第7天應用合適劑量褪黑素(MT)后,SCI大鼠神經元中LC3Ⅱ、beclin-1表達明顯升高,p62表達明顯下降,p-PI3K、p-mTOR和p-Akt表達明顯降低,而神經功能改善明顯,證明MT通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,增強神經元自噬并抑制細胞凋亡,進而改善運動功能障礙[10]。Wang等[11]研究發現,在機械損傷的脊髓神經元中自噬的發生要早于細胞凋亡,并且經PI3K特異性抑制劑LY294002處理后,Akt和mTOR磷酸化水平降低,LC3Ⅱ表達升高,證明SCI后自噬水平與PI3K/Akt/mTOR信號通路活性呈負相關,支持通過抑制該通路適度增加自噬從而發揮治療作用。也有研究通過激活該通路抑制過度自噬來促進SCI的恢復。Zhang等[12]發現堿性成纖維細胞生長因子(BFGF)通過抑制過度自噬來保護運動神經元的存活并改善SCI的恢復,其作用機制與BFGF通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制過度自噬和增強泛素化蛋白清除有關。PI3K/Akt/mTOR信號通路介導了疾病發展,因此通過該通路合理調節自噬能明顯抑制神經元凋亡,促進細胞存活,從而有效保護神經元,最終能應用于疾病的治療。

2.2 MAPK/ERK1/2/mTOR信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,該通路包含了4條分支路線,即細胞外調節蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和細胞外調節蛋白激酶5(ERK5)。其中,MAPK/ERK1/2/mTOR信號通路在SCI中與自噬的關系討論相對較多,其余分支路線研究較為匱乏。ERK由ERK1和ERK2組成,可被神經遞質、神經營養因子等誘導致磷酸化而被激活,活化后的ERK1/2激活下游靶蛋白,參與調控細胞的自噬、凋亡、增殖、分化等重要的細胞過程。

MAPK信號通路在SCI的發展進程中扮演著重要角色。據報道,在SCI發生后觀察到MAPK/ERK信號通路激活明顯增強,而MAPK的特異性抑制劑PD98059減輕了SCI相關的炎癥和組織損傷的發展程度[13]。雖然近年來有關MAPK信號通路如何調控自噬一直受到人們的關注,但由于其參與調控SCI中自噬的機制極其復雜,所以目前的研究似乎還存在相互矛盾的情況。例如,Tang等[14]用雙過氧釩(bpV[pic])處理大鼠SCI模型中發現ERK1/2磷酸化水平升高,細胞自噬增強,而在使用ERK1/2抑制劑SCH772984后,bpV(pic)引起的自噬增加被逆轉,證明了bpV(pic)通過激活ERK1/2信號促進自噬,抑制細胞凋亡,從而減少神經元丟失。而Zhu等[15]在有關雷公藤甲素(TP)干預SCI的研究中發現ERK1/2的磷酸化水平降低,細胞自噬增強,神經元細胞死亡減少,表明TP通過抑制ERK1/2信號通路增強自噬發揮其在SCI中的保護作用。產生矛盾的研究不僅僅存在上述文獻中。SOX2是SOX基因家族的“創始成員”之一,可抑制MAPK通路的激活。Li等[16]發現在SCI大鼠中給予miR-103模擬物上調了SOX2的表達,降低了p-ERK和p-MAPK的表達,有趣的是,該研究同時表明miR-103過度表達降低了細胞自噬水平,起到了對SCI的保護作用。可以看出,通過該通路抑制還是增強自噬對SCI起到保護作用存在疑惑,且近年來的研究也發現無論是激活還是抑制該通路均可誘導自噬的發生,但其具體機制不詳。因此,MAPK信號通路在SCI中誘導細胞自噬作用的精細分子機制,值得更深入的研究。

2.3 AMPK信號通路

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)由α、β、γ 3種亞基構成三聚體,其活性主要受細胞內AMP/ATP的比值影響,當機體處于能量匱乏狀態時,AMP/ATP比值升高激活肝激酶B1,磷酸化α亞基導致AMPK表達的上調,AMPK的上調可通過兩種方式:磷酸化結節硬化復合物(TSC2)或直接通過Raptor,以抑制下游信號因子mTORC1的活性,從而參與自噬的調控[17]。并且,AMPK上游信號因子ULK1、p53和下游信號因子p27kip1也均能參與自噬的誘導,這提示我們深入研究AMPK相關信號通路,有助于我們理解SCI中自噬的具體機制。

圍繞AMPK/mTOR通路,大量研究證明了其對SCI存在影響。研究顯示,在SCI后AMPK磷酸化顯著增強,mTOR磷酸化明顯降低,表明AMPK/mTOR信號通路被激活[18]。SCI大鼠模型經二甲雙胍治療后功能改善,LC3、beclin-1表達增加,同時檢測到AMPK的激活及其下游mTOR信號的抑制,提示AMPK信號通路參與了二甲雙胍調節自噬流的過程[19]。類似的實驗結果也出現在鋅[20]、白藜蘆醇[21]等藥物的研究中。轉錄因子EB(TFEB)在以往的研究中被認為是參與自噬調控的中樞因子,并參與調控溶酶體的合成[22]。TFEB會被各種細胞應激所激活,觸發AMPK的磷酸化,伴隨AMPK/mTOR的激活,mTORC1的失活不再磷酸化TFEB[23],使TFEB的核轉位得以實現。神經突起導向因子-1(netrin-1)因在胚胎及神經系統發育中發揮軸突導向功能而備受關注[24]。最新研究發現[25],netrin-1可通過AMPK/mTOR/TFEB通路調節大鼠SCI后TFEB的磷酸化狀態,從而促進溶酶體的生物發生,有利于自噬小體的降解,激活自噬流,達到抑制神經元凋亡、促進功能恢復的目的。樺木酸被證明同樣通過AMPK/mTOR/TFEB信號通路,增強了SCI中的自噬,增加的自噬又誘導線粒體自噬,減少ROS積累,抑制焦亡,有利于SCI的治療[26],這提示我們通過AMPK/mTOR/TFEB信號通路調控TFEB的核定位來調控溶酶體的發生發展可能是一種潛在的治療SCI的策略。

2.4 NF-κB信號通路

核因子κB(NF-κB)家族有5個成員,包括p50、p52、p65、Rel-B和c-Rel。NF-κB蛋白由p65和p50亞單位構成二聚體,并與抑制蛋白IκB結合構成三聚體復合物而處于失活狀態。IκB蛋白家族則包括IκBα、β、γ、ε、p100、p105等諸多成員。該通路的激活常見于典型途徑和替代性途徑:典型途徑由促炎細胞因子等觸發,而替代性途徑由IKKa誘導p100磷酸化,導致Rel-B/p52異二聚體激活,這些途徑的特點是對IKK亞單位的不同需求,IKK復合物由兩個激酶亞基(IKKα和IKKβ)和一個調節亞基(IKKγ)組成。當刺激因素激活NF-κB后,磷酸化IKKβ亞基,IκB被置換出來并受到蛋白酶體降解,從而活化NF-κB并使其易位進入細胞核,進而參與調整細胞的炎癥、自噬、凋亡等功能。

在有關SCI的研究中,基于NF-κB通路探討自噬的研究尚少,主要是通過與其他通路串擾誘導炎癥等反應來探討與自噬的相互作用機制。炎癥反應貫穿于SCI的整個發生發展過程,通過抑制NFκB通路可減輕炎癥反應并改善功能恢復[27]。值得注意的是,NF-κB與自噬之間也存在著廣泛的聯系和復雜的調控機制[28]。這種調控機制通常不是單純的促進或者抑制,而是表現為雙向調節:NF-κB能夠誘導自噬相關蛋白的表達來促進自噬的發生;而自噬又能夠下調IKK復合體,抑制NF-κB通路[29]。SCI最初(數小時內)的炎癥反應會加重中樞神經系統后期的損傷,而快速誘導自噬可能有助于維持局部微環境穩態和減輕神經元損傷。Guo等[30]建立小鼠脊髓半切模型后注射粒細胞集落刺激因子(GCSF),發現SCI后自噬被激活,且G-CSF處理組自噬的激活更為迅速,并對NF-κB信號通路產生抑制,認為G-CSF在SCI后的及時使用可通過抑制NF-κB信號通路促進自噬,保護SCI后的神經元結構。另有研究指出[31],ω-3游離脂肪酸通過增強自噬降解炎性復合物從而減輕炎癥,也可抑制NF-κB活化來阻止炎癥啟動,提示NF-κB、自噬與炎癥之間存在著潛在的相互聯系。然而,在其他很多疾病環境下,NF-κB信號通路對自噬起激活作用[32],也可以起失活作用[33],其介導自噬對機體本身可以是保護機制[34],也可加重疾病的發展[35]。提示NF-κB通路的作用機制仍然存疑,這種差異可能來自于不同的刺激環境、細胞類型和細胞狀態。但毫無疑問的是,在SCI中,自噬與炎癥存在廣泛的交互調控機制,而NF-κB信號通路可認為是構成“脊髓損傷-自噬-炎癥”鏈條的關鍵通路,值得進一步深入研究。

2.5 其他自噬相關通路

2.5.1 p53信號通路

p53作為自噬調節過程中的關鍵分子,根據其細胞定位的不同在自噬調節中發揮雙重作用。細胞核內的p53促進細胞自噬,而胞漿中的p53發揮著抑制細胞自噬的作用[36]。細胞核中的p53通常通過三方面促進自噬,一是p53通過激活損傷相關自噬調節因子(DRAM)、死亡相關蛋白激酶(DAPK-1)等自噬基因,二是解除mTOR對自噬的抑制作用,三是誘導凋亡調節因子(TIGAR)表達并抑制ROS的產生來激活自噬[37]。而細胞質中的p53則通過抑制AMPK活性或激活mTOR來抑制自噬的發生[38]。大量研究也表明P53信號通路在SCI后發揮著重要的調控作用,可參與調節軸突生長和可塑性、膠質和纖維化瘢痕形成,以及影響運動功能恢復的小膠質細胞/巨噬細胞增殖[39]。進一步將p53信號通路與SCI中自噬的調節聯系起來,充分發揮不同階段p53信號通路對細胞自噬的調節作用進而治療SCI是十分有必要的。

2.5.2 Keap1/Nrf2/ARE信號通路

核因子E2相關因子2(Nrf2),受Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)的調控,通過與抗氧化反應元件(ARE)結合,在細胞內發揮著抗氧化和抗炎的重要作用。研究表明SCI后激活的Nrf2/ARE信號通路可以減少炎性反應并促進神經功能恢復[40]。在正常情況下,Keap1將Nrf2收集在細胞質內,嚴重SCI后自噬流的阻斷導致自噬相關底物p62的蓄積,過多的p62通過將Nrf2和Keap1置換出來與Keap1結合[41],被置換出的Nrf2進入細胞核中激活多種抗氧化基因和NF-κB等的轉錄,抑制氧化應激相關蛋白的表達[42],減少損傷后的炎性反應,改善SCI后運動神經元的恢復[43]。抑炎、抗氧化應激、促自噬等作用表明該通路是治療SCI的有效潛在靶點。

2.5.3 BDNF/TrkB信號通路

腦源性神經營養因子(BDNF)與酪氨酸激酶受體B(TrKB)結合,通過激活下游多個信號通路參與神經可塑性、細胞存活、軸突生長等多種重要的細胞生命活動[44]。并且,BDNF在調節SCI自噬中具有關鍵作用,可通過促進自噬來維持神經元存活[45],并且可通過影響PI3K/Akt等自噬相關信號通路來調整自噬,對SCI提供保護性功能[46]。合理調控BDNF/TrkB信號通路從而發揮自噬的保護性功能,對SCI的治療將有積極作用。

此外,還有部分通路如HIF-1信號通路[47]、Wnt信號通路[48]、Notch信號通路[49]、JAK/STAT信號通路[50]等,最新的研究表明通過影響這些信號通路調節自噬,均對SCI的治療產生了有益作用。當然,這些通路的研究目前仍處于起步階段,但治療潛力毋庸置疑,值得深入研究。

3 結論與展望

自噬水平的調整在治療SCI中的重要性是毋庸置疑的,自噬流的變化在某種程度上也反映了SCI的病理變化。并且,SCI中自噬在不同損傷程度、刺激因素、時間模式等影響下是具有保護性還是損害性仍有待明確,但似乎越來越多的證據表明,自噬在SCI中的作用主要是有益的。在信號通路調節自噬的研究過程中,不可避免的出現了許多問題:(1)由于不同信號通路存在交聯,不同的刺激因素對同一條信號通路也會產生不同的結果,如何選擇性的調整某條信號通路對自噬造成影響十分困難;(2)適度的自噬是維持細胞穩態的必要條件,因此如何通過信號通路啟動自噬、調整信號通路使得自噬水平處于適度的區間,需要深入研究;(3)許多藥物可以激活信號通路來對自噬產生影響,但不同藥物、相同藥物不同劑量、藥物的不同使用時間造成的結果存在差異,這與SCI中自噬的動態變化有關,所以明確研究藥物與模型的動態匹配關系十分重要。總之,目前有關SCI的治療尚無徹底解決之道,但無論自噬還是相關信號通路在SCI中的作用機制研究已經成為一種熱潮。深入理解“SCI-信號通路-自噬”的鏈條關系,通過特異性調節相關信號通路,從而維持自噬流的通暢和合適水平,進而對SCI發揮保護性功能,將為我們治療SCI提供新的有效靶點。