MNNG溶液聯合多因素誘導胃癌前病變大鼠模型研究進展

陳心怡舒 勁

(1.甘肅中醫藥大學,中醫臨床學院,蘭州 730030;2.甘肅省中醫院,脾胃病科, 蘭州 730050)

胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer,PLGC),是腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)及異型增生(dysplasia,Dys)的病理變化過程,是慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)的常見病理表現。Correa[1]提出基于胃癌的發生經過“正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→癌(腸型)”已被不斷證實,PLGC被認為是CAG 發展至胃癌的關鍵環節,因此,如何建立起更加貼近臨床病癥的動物模型,成為了研究胃癌前病變的重要前提。N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)是集誘變與致癌作用為一體的化學試劑,它能夠直接作用于DNA,使堿基烷化發生在DNA鏈上而產生致癌作用[2]。MNNG等化學致癌物誘導的大鼠模型因其操作簡單,成本低廉,在胃癌前病變動物模型中被廣泛應用[3]。然而其濃度、給藥方式及其他配合因素的選擇目前還存在爭議,結合PLGC之病理變化具有動態的特殊性,本文將聯合多因素綜合闡述基于MNNG溶液作用下的造模研究進展。

1 MNNG溶液給藥方式及濃度

MNNG溶液給藥方式有自由飲用與灌胃兩種,具體選擇要根據大鼠種類、實驗周期、研究方向而定。人類所患的95%胃癌類型為腺癌已被證實,MNNG溶液因為甲基化程度的因素,對腺胃更具有親和力[4-6]。陸鈺婷等[7]提出自由飲用狀態下大鼠模型病變部位大多發生在腺胃,故此方式能更接近自然因素。但同時容易受大鼠本身習性不同的影響,容易造成攝入量和造模效果上的差異。故可以將自由飲用與灌胃結合起來使用,灌胃方式可以提高模型的誘變率,減少對大鼠的肝、十二指腸的損害[8]。但是對于大樣本量的研究,無形中增加了因操作因素造成的誤差,比如會引起部分大鼠腸脹氣或食管水腫,所以目前對于兩種給藥方式的選擇還未給出一個標準,具體的選擇要根據大鼠樣本量及實驗周期而調整。除此之外,MNNG溶液的濃度也需要進行控制,濃度低則會延長造模周期,難以達成預期效果,濃度過高會對大鼠的肝腎引起毒性反應,甚至直接引發胃癌,與造模目的不符。周晶等[9]在胃癌前病變的模型探討中證實,自由飲用的濃度應在50～120 μg/mL之間,灌胃濃度普遍較自由飲用濃度高,多數介于80～250 μg/mL之間。馬林等[10]在慢性萎縮性胃炎的造模文章中指出,MNNG溶液在CAG的大鼠造模中濃度不宜超過120 μg/mL,這對建立胃癌前病變的模型具有參考意義,可適當增加濃度以保證效果和預期攝入量。

2 MNNG溶液4種復合法

目前學者們最常用到的PLGC大鼠造模方法為MNNG溶液復合法[11]。此方法是以用一定濃度的MNNG溶液自由飲用或灌胃的方法為主,飼料選用0.03%鹽酸雷尼替丁飼料,再聯合0.1%氨水或水楊酸鈉溶液或乙醇,在饑飽失常或物理刺激的情況下組合使用的多因素聯合造模方式。下文例舉出4種較為常用的方案,此4種方法都選用了0.03%雷尼替丁飼料,鹽酸雷尼替丁為強效H2受體阻斷劑,能抑制胃酸及胃蛋白酶的分泌,胃內低酸環境能促進腸上皮化生的發生,且口服的方法下生物利用度最高,故作為造模因素使用時,為了持續發揮抑制胃酸分泌的作用,常與大鼠飼料充分混合后自由進食[12-14]。

2.1 MNNG溶液灌胃+氨水自由飲用

魏玥等[15]以120 μg/mL濃度的MNNG溶液灌胃,配合自由飲用0.1%的氨水溶液,飼料為已被廣泛應用的0.03%鹽酸雷尼替丁飼料,20周后造模成功。本方案采用的大鼠為Wistar大鼠,其性格溫順,抵制傳染病能力強,自性腫瘤發生率低,適宜短期灌胃[16]。湯小芳等[17]在PLGC大鼠的造模中也選擇了灌胃的給藥方式,每日給予180 μg/mL的MNNG溶液,于第22周出現腸上皮化生。灌胃法的優點是誘變率強,不易受個體差異的影響,能保持一定濃度和劑量的攝入量,但容易因為操作人員的失誤而導致大鼠出現腸脹氣、食管水腫,使得死亡率升高。此方案還聯合了0.1%氨水的自由飲用,陳璐等[18]在CAG大鼠的研究中也運用了此方法,8周后大鼠均出現不同程度的胃炎。氨水可模擬幽門螺桿菌(Hp)作用于胃黏膜產生高氨的毒性損害及感染,造成其持續胃炎狀態,實驗中一般選用0.05%～0.1%的氨水于禁食日自由飲用[19]。本方法采用了單一的灌胃給藥方式,對MNNG溶液的利用率高,減少一部分因個體差異造成的額外試劑耗費,與持續造成胃炎狀態的氨水聯合作用,在樣本量小于100只的情況下,此方案縮短造模時間,配合效果佳。

2.2 MNNG溶液自由飲用聯合灌胃+饑飽失常

Tong等[20]取用SD大鼠自由飲用170 μg/mL的MNNG溶液配合灌胃1 mL/100 g濃度的MNNG;饑飽失常頻率為進食2 d,禁食1 d,連續10周后成功造模。本方案采取了對MNNG溶液自由飲用加灌胃的方式,自由飲用的優點是最貼近于病因,可展現真實的個體差異,且操作便捷,陳澤慧[21]在實驗操作中發現,由于MNNG溶液不易溶于水,故自由飲用時藥物有殘留現象,容易導致大鼠攝入量不足,影響造模效果。操作者應調整換水周期,控制在18～24 h之間,并在配置時用磁力攪拌器充分攪拌使其溶解,4℃保存[22]。本方案為了減小因個體差異導致的攝入量不同,在MNNG溶液自由飲用的基礎上,聯合了灌胃的方法且此給藥途徑不參與饑飽失常,保證每日最低攝入量,最大程度控制誤差。除此之外,在自由飲用試劑和飼料的同時,聯合饑飽失常法,饑飽失常是一種在正常進食情況下,采取間歇性禁食的實驗方法,模擬臨床上的不規律進食病因,胃酸每天有固定的分泌時間,食物的粘度對胃排空率會造成一定的影響[23-25]。如果胃酸和胃蛋白酶沒有食物去進行中和反應,就會直接酸化胃黏膜,引起胃黏膜下的血管收縮、痙攣等[26]。且空腹狀態下的飲水使MNNG在胃中停留時間比有食物充盈時間縮短,MNNG對胃黏膜刺激減少,對腸道黏膜刺激增加,加重了MNNG致腸道腫脹的不良反應[27]。故于禁食日宜停飲MNNG溶液,一般采用2～3 d進食,1 d禁食的方案,也有采用雙日禁食,單日進食的方法[28]。本方法的側重點在于對MNNG溶液給藥方式的聯合,以最大程度的控制MNNG溶液的定量攝入,是理想的給藥方式,但因給藥方式的聯合,故需要針對不同方式制定不同的濃度及試劑保存方式,對于自由飲用的MNNG溶液需要1周進行1次溶解,18～24 h換1次水,對于灌胃用的溶液則需注意儲存方式,同時隨時觀察大鼠的毛發光澤、精神狀態等以調整濃度。

2.3 MNNG溶液灌胃+水楊酸鈉溶液自由飲用+高鹽燙飲食

任金剛等[29]采用SD大鼠自由飲用2%水楊酸鈉溶液配合10 mL/kg的MNNG溶液灌胃,每周禁食1次,自第14周起禁食第2天灌胃高鹽熱淀粉糊3 mL,給藥28周后造模成功。此方案的預實驗中,MNNG溶液的給藥方式為自由飲用,但發現大鼠飲水量較少,認為與溶液的刺激性氣味有關,故改為灌胃。而水楊酸鈉無刺激性氣味,接受度高,最終采用聯合水楊酸鈉溶液自由飲用的方案。劉凱歌等[30]在研究胃癌轉化的機制中也選用了2%水楊酸鈉溶液灌胃的聯合造模方式,于第26周造模成功。水楊酸鈉溶液屬于非甾體類抗炎藥(NSAIDs),其機理為降低環氧化酶以活性消炎止痛,通過抑制胃粘膜因子的生長,直接刺激粘膜細胞壞死引起炎癥反應,故常用低劑量的水楊酸鈉溶液造成大鼠的胃炎反應[31]。另外聯合高鹽燙的不良飲食習慣,獨思靜等[32]在實驗的第九周用高鹽熱淀粉糊灌胃后,大鼠的胃泌素顯著降低。食鹽有過高的滲透壓,能抑制前列腺素E2的合成從而造成胃酸分泌不足,損傷胃黏膜,并結合食物中的硝酸鹽,在胃內分泌出有強致癌性的亞硝酸銨[33-35]。另外過高溫度的食物會對消化道黏膜產生燙傷,反復的燙傷會引起黏膜的質變,進一步則會產生癌變,再加上淀粉糊狀物不易消化,容易引起胃腸道功能的紊亂,但糊狀物需要大半徑的灌胃針,若操作不當易對大鼠食道造成額外傷害。此方案運用灌胃方式結合易接受、攝入量高的水楊酸鈉溶液、加以高鹽燙飲食,雖造模時間較長,但在保證試劑致病量的前提下,以非甾體類抗炎藥和高熱燙因素聯合持續胃炎狀態,與MNNG溶液配合效果良好。

2.4 MNNG溶液自由飲用+氨水自由飲用+乙醇灌胃+饑飽失常

孔祥茹等[36]取用SD大鼠以100 μg/mL的MNNG溶液自由飲用,每進食2 d,再禁食1 d,禁食日用20%乙醇灌胃,每只2 mL,再用0.1%氨水自由飲用,持續28周后造模成功。此方案采用了自用飲用MNNG溶液的給藥方式,聯合氨水和乙醇,在饑飽失常的狀態下進行。其中乙醇溶液起到輔助溶解MNNG溶液的作用,提高利用率,縮減一定的成本,但同時乙醇灌胃會導致肝細胞脂肪變,血竇組織及其小葉中央靜脈產生病變[37-39]。乙醇和MNNG溶液會不同程度的造成大鼠胃腸脹氣,而且胃腸脹氣會導致大鼠撕咬從而造成死亡。故聯合乙醇溶液因素時應慎重選擇乙醇濃度及干預頻率,且宜于禁食日停MNNG溶液改用20%乙醇灌[40]。其給藥方式為自由飲用,其一能降低大鼠死亡率,其二因其造模周期長,樣本量大,自由飲用的方式可縮減操作程序,最大程度的減少失誤[41]。再聯合氨水自由飲用可造成Hp感染狀態、聯合乙醇灌胃可輔助MNNG溶液更高效率的發揮作用,聯合饑飽失常能模擬不規律進食對胃黏膜的損傷,且空腹飲水使得MNNG在胃中停留時間比食物充盈時間短,對腸道黏膜刺激增加,加重了MNNG致腸脹氣的不良反應,故此方案在上述因素聯合下能發揮成功的造模效果。

3 討論

目前關于PLGC大鼠模型的研究主要圍繞其造模周期、MNNG溶液的給藥方式、濃度及其聯合因素的應用而展開。總結上述內容發現胃癌前病變的造模周期通常跟隨給藥方式及濃度而變化。在實驗中為了減小誤差,提高誘變率,MNNG溶液與其聯合溶液的給藥方式常呈交替式出現,其濃度與劑量也根據給藥方式的不同而調整,自由飲用時濃度較低,劑量較高;灌胃時濃度較高,劑量較低。在聯合因素的選擇上,通常將飲食習慣、化學因素與物理因素三者結合起來,與致癌劑形成輔助作用,且在禁食日采用氨水或乙醇或水楊酸鈉溶液等聯合因素,但過程中要避免藥物之間的拮抗及毒性作用,合理準確的聯合多因素造模才能縮短造模周期、減少資源損耗及提高成模效率。

4 小結

筆者認為病理發生過程是由多因素同步且綜合作用下產生的表現,這一點在胃癌前病變的過程中更加得到顯著體現,它是從萎縮性胃炎到不完全大腸型化生到中度的異型增生再到癌變的一個漫長過程,所以癌前病變更是需要動態觀測其炎癌轉化的中間環節,建立高效的動物模型是此研究前提和根基。目前PLGC大鼠造模主要圍繞MNNG溶液復合法進行研究,但其造模周期、給藥濃度及途徑及聯合因素的選擇還未產生一個標準,故采用MNNG溶液多因素復合法分析每套方案中每個因素的利弊,在復雜的研究中找到實驗突破點,在曲折的實驗過程中找到研究創新點,以建立更標準且高效的動物模型。