膝骨關節炎實驗動物模型現狀研究進展

李書博，陳 赫，孫 云，魏敏章，宋坤玉，尹宏兵，崔鎮海

（1. 長春中醫藥大學，長春 130117；2. 長春中醫藥大學附屬第三臨床醫院，長春 130117）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種因過度勞損、外傷、不良體位、體質量過重等原因引起的慢性、退行性骨關節病，基本病理改變為關節軟骨變性和丟失、滑膜增厚、韌帶和關節囊病變以及關節邊緣和軟骨下骨質再生[1-4]，臨床上主要表現為膝關節疼痛、腫脹、關節僵硬、活動受限甚至關節畸形等。雖然最新研究[5]提出應按照患者個人情況及癥狀、體征等采用具體的治療方案，以提升個人生活質量。但實際上因為KOA的病因病機非常復雜，目前不能完全解釋，早期的診斷尚不成熟，而常用的西藥治療絕大多數為非甾體抗炎藥，長期服用會產生胃腸道出血、穿孔、甚至心血管疾病等不良反應，某些程度上阻礙了其臨床應用[6-7]。所以現階段中西醫治療仍以緩解癥狀、減緩病情發展為主。鑒于以上情況，以人為研究對象多有不便甚至違背倫理道德，因此通過創建簡便可行的KOA動物模型，用以發掘KOA的發病機制、尋找合理有效的診療和預防方法成為研究 KOA的必經之路。

1 動物模型選擇

科研人員在造模之前首先考慮的問題就是實驗動物的選擇。因為動物實驗的最終目標是運用到臨床，作用到人體，所以首先要考慮所選動物基因與人類基因是否相似。其次是生理結構、基礎代謝、疾病特點是否與人類相似。最后是所選動物是否容易飼養、費用、倫理問題等。把上述問題歸結到一起再進行綜合選擇。

1.1 小型動物模型

1.1.1 小鼠 小鼠基因組測序中蛋白質編碼基因與人類相似度較高[8]，故可作為基因技術的常用模型，且適應能力較強，容易獲取，費用較低。但不足之處是小鼠體型較小，在對膝關節進行操作時多有不便。

1.1.2 大鼠 大鼠膝關節軟骨及滑膜的損傷與其他動物相比更迅速，病程變化較短，也常用于基因技術的造模，不足之處與小鼠一樣，由于體型較小，膝關節也較小，對手術操作要求較高。

1.1.3 豚鼠 豚鼠與人類KOA組織病理學類似，且性格溫順，常常久坐不動，因為身體結構的原因，隨著年齡逐漸增加，5月齡會逐漸形成自發性膝骨關節炎[9]。因此常用來作為自發性膝骨關節炎模型。

1.2 中、大型動物模型

1.2.1 兔 兔的體型與鼠類相比較大，膝關節除髕骨外，大體與人類似，且在形態學方面其關節軟骨損傷后的修復亦與人軟骨修復相似[10]，因此是手術操作及關節固定法等的理想模型。但由于兔的膝關節幾乎總是處于屈曲形態，在生物力學上與人類不同，所以不適合功能性研究。

1.2.2 狗 狗的膝關節腔較大，更易于作為手術及操作的模型，且造模成功率比小型動物要高。另外，狗消化系統中的胃腸道與人類相似，因此可以作相應研究[11]。但是購買及飼養費用較高，術后抗感染能力較小型動物相比較低。

1.3 其他動物

如豬、馬、羊、獼猴等，其關節腔更大，更容易手術操作，尤其是獼猴，這種動物與人類在形態、生理、病理等方面有很高的相似性，因而被用來研究各種與人類相關的疾病[12]。但考慮到費用昂貴，術后護理要求較高，且在倫理方面備受爭議，因此在實驗中運用較少。

2 造模方法分類

KOA造模方法一般分為以下2種：一種是自發性動物造模，指沒有人類干預而自然產生；另一種是誘發性動物造模，指通過人為注射藥物、手術誘導等產生。

2.1 自發性動物造模

2.1.1 天然自發性動物造模 天然自發性KOA模型，是指隨著生長發育的進程，關節軟骨自行退變、老化形成 KOA。目前，常用的實驗動物主要有豚鼠[9]、STR/ort小鼠[13]等。陳松等[14]將3月齡豚鼠飼養2個月后建立自發性豚鼠KOA模型，通過病理切片發現造模后的5月齡豚鼠膝關節軟骨下成骨細胞和成纖維樣滑膜細胞發生明顯改變。此造模方法受外界干擾因素少而且成功率比較高，在研究原發性KOA方面具備獨特優勢。缺點是自發過程所需周期較長，與其相對應的費用也較高，這也是實驗中的弊端。

2.1.2 轉基因動物造模 轉基因KOA動物模型是應用基因技術把外源基因插入動物基因組中，并使之在動物體內表達，或者突變、敲除動物自身基因組中某些基因造成基因缺陷，從而導致軟骨細胞發生異常變化[15]。現階段常用的轉基因動物模型是小鼠，其主要優點是易于進行遺傳修飾[16]。于斐等[17]基因敲除小鼠沉默信息調節因子1（SIRT1），通過激活VEGF/AKT 通路加重骨關節炎關節軟骨的退變，與手術橫斷前交叉韌帶加內側半月板切除法相比膝關節表面軟骨毀損更嚴重，表面發生斷裂，甚至出現軟骨層缺失。轉基因技術優點主要是避免手術創傷對實驗帶來的的影響，提高造模成功率，但是缺點也特別明顯：目前此技術尚不成熟、造模成本較高、且不同動物基因亦不同。由于病毒載體存在潛在的致瘤性等問題及非病毒載體較低的軟骨轉染效率，限制了其應用于臨床，因此轉基因技術應用于人體還需要更多的臨床前研究[18]。

2.2 誘發性動物造模

2.2.1 非手術造模

2.2.1.1 關節腔藥物注射 關節腔內注射法是將藥物注射進膝關節腔內誘導KOA的方法，所用藥物有膠原酶、碘乙酸鹽、尿激酶型纖溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、菲律賓菌素等，其中木瓜蛋白酶、碘乙酸鈉和膠原酶使用最為廣泛。

木瓜蛋白酶可分解軟骨基質中的蛋白多糖，使基質對軟骨的保護能力降低，導致軟骨細胞更易被破壞，同時軟骨降解后碎屑進入滑液，刺激滑膜使其產生炎癥，加快軟骨破壞[19]。湯小康等[20]采用4%的木瓜蛋白酶對大鼠雙膝關節腔進行注射。造模2周后將造模組與空白組大鼠對比發現前者雙膝關節腫脹、行動不便，X線片可見非常顯著的雙膝關節面間隙狹窄，脛骨、股骨關節面磨損，關節邊緣增生等異常表現。另外，模型的損傷程度與木瓜蛋白酶注射濃度呈正相關[21]，使用10%木瓜蛋白酶混合液6周即可制造出重度膝骨關節炎模型。注射木瓜蛋白酶優點是對模型創傷小，所需時間短，造模成功率高。缺點是不同模型所需濃度亦不同，因此劑量較難掌握。

碘乙酸鈉（MIA）是目前OA關節腔注射最常用的化合物[22]，通過抑制Krebs循環的甘油醛-3-磷酸脫氫酶誘導軟骨細胞凋亡，引起軟骨基質改變、軟骨降解丟失、滑膜炎癥等病理改變。鮑哲明等[23]將8周齡雄性Wistar大鼠膝關節注射MIA 2周后發現，大鼠的膝關節軟骨表面出現部分軟骨缺失，軟骨表面不規則，屬于OA疾病中期的病理表現。而在造模 4 周后可見關節表面軟骨大量缺損，軟骨下骨質裸露，關節周圍可見大量骨贅出現，屬于晚期的 OA 程度。此方法操作簡單、對操作者技術要求低，但碘乙酸鈉屬于毒性抑制劑，容易造成大量軟骨細胞凋亡，容易對實驗造成影響。

膠原蛋白酶作用的具體機制是其能水解關節腔內肌腱、韌帶、半月板等組織中的膠原纖維，造成動物內側膝關節脫位，引發膝關節不穩定[24]。Jeong等[25]將膠原蛋白酶注入大鼠關節腔進行造模，12 d后發現滑膜液中IL-6、TNF-α等細胞因子分泌明顯增多，病理組織切片顯示滑膜表面受到損傷，軟骨蛋白聚糖減少，纖維組織排布散亂。相對于木瓜蛋白酶，膠原蛋白酶具有較高的特異性，故有藥物用量少，方法簡便、周期短等優勢[10]。

關節注射法更加簡單、便捷、高效，但此方法的缺點是藥物劑量很難把握，相對誤差較大等，容易給實驗結果帶來影響。例如大劑量、高濃度的木瓜蛋白酶進入血液循環中，會導致肺部溶血從而使實驗動物死亡[26]。

2.2.1.2 關節固定法 是指將關節強制固定于一定體位，按照固定方式可分為屈曲位固定和伸直位固定。屈曲位固定原理是限制動物模型關節運動造成關節周圍肌肉韌帶及關節軟骨萎縮，從而使關節軟骨等組織發生萎縮性變化[27]。田育魁等[28]用改良屈曲位固定法將實驗新西蘭大白兔固定于屈曲位，造模8周后取膝關節部分組織，在光鏡下看到膠原纖維不同程度增多且順序比較混亂，關節軟骨局部表面可見裂隙等。伸直位固定原理改變關節周圍的應力而產生關節軟骨退變[27]。何業文等[29]通過改良伸直位固定法對新西蘭大白兔進行造模，在第2周和第6周分別解剖模型，并制成切片，經 HE 染色等方法觀察結果后發現固定時間與關節炎嚴重程度呈正相關，且動物模型都出現不同程度的軟骨細胞減少及軟骨退變，且大大減少了造模時間。因為伸直位固定導致的KOA和臨床上發病機制比較接近，故在實驗中應用更為廣泛[30]。綜上所述，關節固定法是一種操作簡單、實驗過程可控、成功率高的造模方法，在保證造模效果的同時，避免了手術和藥物對關節腔內結構的影響及破壞。不足之處關節固定法造模相關并發癥較多，主要包括遠端肢體血運障礙、動物一般情況差等[31]。

2.2.2 手術造模

2.2.2.1 傳統 Hulth法及改良 Hulth法 Hulth法是目前常用建立KOA模型的實驗方法之一。傳統的Hulth手術造模方式為將模型手術麻醉后切斷前交叉韌帶、后交叉韌帶及內側副韌帶，并切除內側半月板[32]，即通過打破關節穩定性，使關節面直接摩擦從而形成KOA，傳統的 Hulth法建模更接近于現在臨床上中晚期的KOA。周麗等[33]運用此方法，4周后造模成功。此建模效果得到了廣泛認可，但也存在一些問題，如手術創口較大、切除交叉韌帶后膝關節極不穩定，易導致脫位，從而影響了實驗的不確定性。因此，廣大學者在傳統Hulth手術建模方式的基礎上進行了一些改良，李滔等[12]運用改良Hulth法手術造模，即將動物模型手術麻醉后切斷膝關節內側副韌帶，切除前交叉韌帶、內側半月板，保留后交叉韌帶，并在股骨內側髁關節面切除部分軟骨。6個月后看到關節軟骨及滑膜等組織明顯退變。與傳統Hulth法比較，改良Hulth法對模型造成的手術創傷較小，成功率較高，數據可靠，是目前手術誘導KOA模型的經典方法。但是，對術者的操作、無菌技術及術后護理更加嚴格，此造模方法適用于早、中期膝骨關節炎研究。

2.2.2.2 前交叉韌帶切斷術（ACLT） 前交叉韌帶切斷術（ACLT）也是學者們現階段建立KOA模型的常用方法之一，與Hulth法不同的是，ACLT是將實驗動物麻醉后，在膝關節髕旁處取一切口，只將前交叉韌帶進行切斷，通過打破關節內穩定性來誘導軟骨退變[34]。Tawonsawatruk 等[35]通過ACLT 對大鼠造模，分別于4周、8周、12周進行組織病理學評分，得出結論，造模組明顯高于對照組；12周后HE染色顯示造模組軟骨細胞減少且分布不均。此方法具有操作簡單、結構破壞小的優勢，但不足之處是由于對膝關節應力破壞較小，導致誘導的模型病變進程較緩慢。

2.2.2.3 半月板部分或全部切除術（MMT） 半月板部分或全部切除術（MMT）即將實驗動物麻醉后，切除部分或全部半月板，導致模型膝關節穩定性下降、加大關節面摩擦，從而加重磨損。Parrish 等[36]采用 MMT 對大鼠進行KOA 造模，且術后不限制活動，3周后組織病理染色結果顯示模型關節軟骨鈣化，軟骨下骨硬化及骨贅形成。此方法對動物模型造成的創傷小，與ACLT相比，造模時間短，結果穩定可靠，但仍對關節有創傷，適用于研究創傷性關節炎的病因病機，常與ACLT聯用造模。

2.2.2.4 卵巢切除法 卵巢切除法是通過手術將雌性動物卵巢切除，降低雌激素水平，而骨量流失或者骨質疏松的大部分原因都是因為雌激素缺乏[37]，因此雌激素可能對膝骨關節炎的發展及病變具有抑制作用[38]。譚啟釗等[39]將6只雌性 SD 大鼠在手術前 12 h 禁食，麻醉后減掉卵巢，術后每天注射抗生素連續注射 3 d，預防術后感染。8周后通過關節軟骨組織切片發現軟骨下骨微觀結構的改變顯著增高。此方法涉及的手術操作比較復雜，局限性較高，僅適用于雌性動物，且造模所需時間長。因此，僅適用于女性絕經、骨質疏松的相關研究。

3 討論

動物模型的研究是進行臨床KOA病因病機、治則治法、方藥選擇、日常保健等研究的重要基礎。因此，在選擇動物模型前，需要綜合考慮各個模型的生理特性、經費預算、實驗目的等再進行造模。造模方法多種多樣，但各有利弊：1）自發性造模受到創傷、藥物等其他因素干擾較少，但造模時間較長；2）基因技術成功率較高，但此技術尚不成熟，發展潛力巨大；3）藥物注射操作相對簡單，造模成功率相對較高，對模型造成的傷害較少，但藥物劑量難以把控；4）手術造模時間短，成功率高，但對手術操作要求較高，術后護理要求也高等等。同時應緊跟學科前沿，隨著時代的發展不斷開創出新的動物模型和造模方法，最終應用于臨床診斷與治療。