東營鹽堿土壤浸泡水用于螺旋藻的培養研究

＊彭人勇 徐嘉男 劉天中

（1.青島科技大學環境與安全工程學院 山東 266042 2.中國科學院青島生物能源與過程研究所 山東 266101）

植物和藻類的生物固碳被認為是減排以CO2為主的溫室氣體最有效和可持續的途徑之一。國內外學者針對微藻固碳展開了一系列的研究[1]。全世界鹽堿地存量以及因濫用化肥而土壤鹽堿化增量面積共計約10億公頃，對這些鹽堿（化）土壤的改造是一個世界性難題。目前以土工作業為主的物理修復以及添加改良劑的化學修復等壓堿降鹽方法，均不能從本質上對土壤結構和理化性質進行改善，且成本高、可持續性效果差。利用生物質來提升鹽堿土壤中的有機質含量，從而改善其團粒結構、通氣、透水性的生物修復與工程與生物修復的結合已成為鹽堿土壤的重要趨勢。張巍[2]、Singh[3]等均發現固氮藍藻能夠增加土壤孔隙度，降低可交換性Na+含量，增加土壤有機質。螺旋藻具有生長迅速、有機質含量高[4]，能夠適應多種復雜環境（如污水）等優點，因此利用大水浸泡壓堿排鹽的鹽堿地改造工程中的鹽堿浸泡水進行螺旋藻的培養，既可以實現CO2的固定[5]，又可以為鹽堿土壤提供豐富的有機質，有助于形成鹽堿地改良的長效機制。東營鹽堿地土壤含有大量的Cl-、Na+、SO42-，而植物生長所需的N、P、K等營養離子卻極度貧乏。目前對其采取的水利工程措施（如深耕、埋暗管）、化學措施（如脫硫石膏）、生物措施（如耐鹽堿植物的培養）等改良方法，改良周期較長且易反鹽。本研究擬利用東營鹽堿土壤浸泡水來培養螺旋藻，探討螺旋藻在鹽堿土壤浸泡水的生長特性及對生化組分進行分析，以確定最佳培養條件，提高生長固碳效率，從而為未來建立在鹽堿地大水漫灌土工作業時利用鹽堿浸泡水的螺旋藻培養固碳—有機質提升的土壤改造技術奠定基礎。

1.材料與方法

(1)藻種與培養基

實驗所用螺旋藻藻種（Spirulina platensis）來自中國科學院青島生物能源與過程研究所。其基礎培養基為Zarrouk培養基（g/L）：NaNO32.5，K2HPO40.5，K2SO41，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.01，Na2-EDTA 0.08，NaHCO316.8，1mlA5溶液[H2BO32.86，MnCl2·4H2O 1.8，ZnSO4·7H2O 0.222，Na2MoO40.39，CuSO4·5H2O 0.079，Co(NO3)2·6H2O 0.049。

(2)鹽堿土及其浸泡水

實驗用鹽堿土取自山東省東營市東營區東七路與南二路交叉口（37°24′15.0″N，118°44′10.0″E），取土深度0～10cm，鹽堿土經充分混合、風干、研磨、過篩后備用。利用蒸餾水按照5:1的水土比浸泡該鹽堿土，機械攪拌使其充分混勻后，過濾保存備用。

(3)培養實驗條件和方法

螺旋藻的培養在柱式玻璃光生物反應器中進行。反應器直徑為3cm，高70cm，每次裝液量為300mL。培養以日光燈為光源，光照強度為100μmol·m-2·s-1，實驗室培養溫度控制在24±1℃，并依實驗條件通入含不同體積分數的CO2的混合空氣。

①氮源質量濃度的影響：以1.2獲得的浸泡水為水源按Zarrouk培養基的組成要求進行培養基配制，其中作為氮源的NaNO3設置了4個質量濃度梯度：0.625g/L，1.25g/L，1.875g/L，2.5g/L。

②磷源質量濃度的影響：同上，作為磷源的K2HPO4設置了4個質量濃度梯度：1.343g/L，0.671g/L，0.500g/L，0.336g/L。

③光照強度的影響：實驗中設置了6 個光強：即20μmol·m-2·s-1，50μmol·m-2·s-1，90μmol·m-2·s-1，120μmol·m-2·s-1，150μmol·m-2·s-1，200μmol·m-2·s-1。

④光照周期設置了3個光照周期（L/D）：10:14，14:10，24:0。

⑤無機碳源的影響：利用CO2替代NaHCO3，通氣量為0.2vvm，設置了5個CO2（v/v）體積分數梯度，即0.038%（空氣），1%，2%，3%，5%。

⑥簡易培養基對螺旋藻培養的影響：以1.2獲得的浸泡水為水源，只添加氮和磷元素，并設置不同的質量濃度：A.添加0.500g/L K2HPO4，改變NaNO3質量濃度：0.75g/L，1g/L，1.25g/L，1.5g/L，1.75g/L，2.5g/L；B.添加2.5g/L NaNO3，改變K2HPO4質量濃度：0.671g/L，0.500g/L，0.448g/L，0.395g/L，0.336g/L。

(4)分析方法

①生物量的測定

吸取5ml（V）的藻液，抽濾至事先稱重過的醋酸硝酸纖維素膜（W0），并用3倍的去離子水沖洗3次，去掉附著在細胞表面的營養鹽分，置于105℃烘箱中烘干至恒重后再次稱重（W1），生物量計算方法為W0=(W1-W0)/V[6]。

②固碳速率計算

CO2固定速率計算公式如下：CO2的最終固碳速率（Rc）與生長率（Px）和干藻細胞含碳量（Ce）有關，

其中，X1和X2分別為t1和t2天的生物量；Ce為干藻細胞含碳量，通常藻細胞中分子量為CO0.48H1.83N0.11P0.01；Mco2為CO2的相對分子質量；Mc是C的相對原子質量。

③生化組成分析

藻液離心后收集藻細胞，利用冷凍干燥機凍干后，稱取一定量的干燥藻粉，加入石英砂，充分研磨后，利用元素分析儀[7]進行氮元素的測定，采用苯酚-硫酸法測定藻細胞中多糖含量。

④培養基中NaNO3-N和K2HPO4-P質量濃度的測定

NaNO3-N的測定：新鮮藻液離心后去數毫升上清液，置于石英比色皿中，利用紫外分光光度計測量；K2HPO4-P的測定：參考《中華人民共和國國家標準GB11894-89水質總磷的測定鉬酸銨分光光度法》。

⑤鹽堿土壤可溶性鹽含量的測定

取處理后土壤與蒸餾水按照1:5的比例混合，充分震蕩混合3min后過濾，取濾液利用離子色譜進行測定；碳酸根和碳酸氫根含量利用雙指示劑滴定法進行測定；土壤pH值利用pH計進行測定。

2.結果與分析

(1)土壤可溶性鹽含量測定

鹽堿土壤浸泡液可溶性鹽含量如表1所示。土壤中含有大量的C l-和Na+，總量達到土壤可溶性鹽含量的91.3%，NH4+和HCO3-含量較低，但K+、Mg2+、Ca2+等離子較豐富，未檢測出磷元素和CO32-含量。比較螺旋藻生長的Zarrouk培養基組成可知，要用浸泡水來培養螺旋藻，必須加入必要質量濃度的氮源和磷源。

表1 鹽堿土壤可溶性鹽含量的測定（c/mg·L-1)

(2)氮源和磷源質量濃度對螺旋藻生長的影響

圖1為在不同培養條件下連續培養15d時，螺旋藻的生物量變化。實驗結果表明：氮質量濃度為2.5g/L時，最高生物量可達14.36g/L（圖1-a）；磷質量濃度過高或過低均不利于螺旋藻的生長，0.5g/L為其最適磷質量濃度，此時螺旋藻所能達到的最大生物量為12.49g/L，明顯高于其他實驗組（圖1-b）；雖然鹽堿土浸泡水中Na+和Cl-質量濃度較高，對螺旋藻細胞的生長影響不明顯，表明螺旋藻能夠耐受較高質量濃度的鹽分。

(3)光照條件對螺旋藻生長的影響

不同光照強度條件下螺旋藻的生長情況如圖2（a）。隨著光照強度的增加，螺旋藻的生長速度加快，在120μmol·m-2·s-1時生物量最大，達到11.68g/L，但當光強大于120μmol·m-2·s-1后，螺旋藻的生長會受到光抑制，這與Converti A等[8]的研究結果相一致，表明120μmol·m-2·s-1左右的光強是螺旋藻生長的飽和光強。按照夏季和冬季不同的晝夜時長，本研究選擇光/暗比分別為10:14和14:10，以24h光照為參照時進行螺旋藻培養，結果如圖2（b）所示。在24h光照條件下螺旋藻生物量最高，達到10.95g/L；相比全光照，光暗的交替使螺旋藻生物量的積累變慢，且這一趨勢隨著光照時間的減少而愈加明顯。在后期實驗中，采用光強為120μmol·m-2·s-1、24h光照的條件進行培養。

(4)螺旋藻對CO2的利用

Zarrouk培養基中含有大量的NaHCO3，一方面用來為螺旋藻的生長提供碳源，另一方面調節培養基的pH值，使之能夠在適宜的堿性條件下正常良好地生長。除了NaHCO3，也可以利用CO2作為碳源培養螺旋藻，這樣既可減少無機鹽的使用，又有利于實現CO2的固定。本研究考察了在不添加NaHCO3的情況下，不同體積分數的CO2氣體對螺旋藻生長的影響。如圖3（a）所示，當CO2體積分數由對照的0.038%（空氣）增長到3%，生物量迅速增加。當CO2體積分數超過3%時，生物量降低，這表明本實驗中，3%是最佳的CO2體積分數。

通入不同體積分數CO2下螺旋藻的CO2固定速度變化如圖3（b）所示。與對照的通入空氣相比，3% CO2(v/v)體積分數下螺旋藻的生長達到最大值，對應的固碳速率也達到最大值，為2.21g·L-1·d-1，繼續升高CO2體積分數，螺旋藻固碳速率降低。

(5)簡易培養基培養螺旋藻

前述結果表明鹽堿土壤浸泡水來配置Zarrouk培養基可以很好地用于螺旋藻培養。但Zarrouk培養基中除氮磷外的全微量元素的加入是不經濟的。因此基于成本考量，本研究進一步考察了直接用鹽堿土壤浸泡水適當添加氮、磷元素和通入體積分數為3% CO2（v/v）配置簡易培養基中螺旋藻的生長情況。

在加入0.5g/L K2HPO4和不同質量濃度的NaNO3下的簡易培養基中螺旋藻的生長情況如圖4（a）所示。NaNO3質量濃度從0.75g/L升高到2.5g/L時，培養8d后螺旋藻細胞質量濃度約為6.5～7.5g/L，與圖1（a）的Zarrouk全培養基下螺旋藻的生長差別不大，表明鹽堿土壤浸泡水中的微量營養元素能夠滿足螺旋藻生長所需。氮質量濃度的高低對螺旋藻的生長速率影響不大。

土壤浸泡水中加入不同初始質量濃度NaNO3的簡易培養基培養螺旋藻過程中培養基氮質量濃度的變化如圖4（b）所示。從圖4（b）中可以看出，隨著培養過程的進行，培養基中的氮源逐漸被消耗。不同初始氮源質量濃度的簡易培養基中氮源的消耗速率基本相同，只是當初始氮源質量濃度較低時，如初始NaNO3質量濃度分別是為0.75g/L、1.0g/L、1.25g/L，1.5g/L和1.75g/L時，培養基中的氮源分別是在2d、3d、4d、5d和6d就基本上就被螺旋藻細胞完全吸收。但比較圖4（a），即使培養基中氮源在被消耗完全后，細胞的生長仍然沒有停止。這可能與螺旋藻的生化組成特性相關。不同于其他微藻，螺旋藻細胞的主要組成部分是蛋白質，其從培養基中的高效攝取的無機氮主要用于蛋白質的合成。當外界環境中氮源不足時，蛋白質的繼續積累雖然受限，但螺旋藻能夠分解利用自身合成蛋白質繼續供給細胞固定CO2合成有機碳等骨架分子繼續生長。從表2所示不同初始NaNO3質量濃度下培養獲得的螺旋藻細胞的蛋白質和多糖組成可以看出，當培養基初始氮質量源濃度較低時，螺旋藻細胞中的蛋白質含量較低，只有18%～25%，而作為諸能物質的多糖等碳水化合物受氮脅迫誘導，含量較高，可達20%～30%。而當培養基中氮源充足時，如NaNO3為2.5g/L時，其8d培養終點的螺旋藻細胞中蛋白含量最高，可達47%左右，這個時候細胞的多糖含量卻只有16%左右。這與Madkour[9]所報道結果相一致。培養基成分的改變導致藻細胞中生化組分發生變化。

表2 不同NaNO3質量濃度培養螺旋藻中蛋白質和多糖的含量分析

同樣，在加入0.75g/L NaNO3及不同質量濃度的K2HPO4下的簡易培養基中螺旋藻的生長情況如圖5（a）所示。類似地，K2HPO4質量濃度從0.336g/L升高到0.671g/L時，培養8d后螺旋藻細胞質量濃度約為5～6g/L，與圖1（b）的Zarrouk全培養基下螺旋藻的生長相比，差別不大。初始磷質量濃度的高低對螺旋藻生長速率的影響也不明顯。

上述這一結果表明，只要在鹽堿土壤浸泡水中加入適量的氮和磷源，鹽堿土壤浸泡水中的微量營養元素能夠滿足螺旋藻生長所需。

土壤浸泡水中加入不同初始質量濃度K2HPO4的簡易培養基培養螺旋藻過程中培養基磷質量濃度的變化如圖5（b）所示。從圖中可以看出，與圖4（b）中氮的消耗類似，隨著培養過程的進行，培養基中的磷源在培養前期均快速被消耗。K2HPO4質量濃度較低時（0.336g/L和0.395g/L），培養第二天磷的吸收率就達到92%以上。隨著初始磷質量濃度的增大，磷源的完全吸收時間延長，如當K2HPO4質量濃度為0.671g/L時，培養基中的磷源在第5天才被完全吸收。相較于氮元素，同大多數微藻一樣，螺旋藻在生長初期對于磷源的吸收速度更快。與圖5（a）相似，即使在培養基中磷源被消耗吸收后，細胞的生長仍在繼續。有研究發現，微藻吸收的無機磷酸鹽能夠以多磷酸鹽的形式儲存在藻細胞的多磷酸鹽顆粒中，當培養基中磷源缺少時，這些顆粒就會消失，釋放出磷源供細胞生長。從表3可以看出，與氮源對微藻細胞組成的影響不同，不同初始K2HPO4質量濃度下螺旋藻細胞中的蛋白質及多糖含量的變化不大，蛋白質含量在40%～46%之間，多糖含量在11%～16%之間，這與正常培養基NaNO32.5g/L，K2HPO40.5g/L條件下螺旋藻中蛋白質與多糖含量相差不大，由此推斷出磷元素對螺旋藻細胞生物量及生化組分變化的影響弱于氮元素對藻細胞的影響。

表3 不同初始K2HPO4質量濃度的簡易培養基中培養螺旋藻的蛋白質和多糖含量

3.結論

利用東營鹽堿土壤浸泡水培養螺旋藻，考察了不同氮源和磷源質量濃度的鹽堿土壤浸泡水Zarrouk培養基、光照條件、通氣二氧化碳質量濃度等對螺旋藻生長的影響，結果表明，利用表明鹽堿土壤浸泡水的Zarrouk培養基完全可用于螺旋藻的培養。在此基礎上考察了土壤浸泡水中只加入氮源和磷源和簡易培養基對螺旋藻培養的影響，表明該簡易培養基培養螺旋藻的效果與Zarrouk全培養基無明顯差別。培養基質量氮源濃度和磷源質量濃度對螺旋藻生長影響不大，但低氮源質量濃度下抑制了螺旋藻蛋白質的合成，促進了細胞多糖的合成。東營鹽堿土壤浸泡水加入2.5g/L的NaNO3和0.50g/L的K2HPO4，可以支撐螺旋藻的快速生長。研究結果為未來建立在鹽堿地大水漫灌土工作業改造時利用鹽堿浸泡水培養螺旋藻來實現固碳—有機質提升的土壤改造技術奠定了基礎。