醬油中可培養抗逆微生物研究進展

◎ 楊 勇，趙陽娟，劉 希，童 星

（1.廣東海天創新技術有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.佛山市海天（高明）調味食品有限公司，廣東 佛山 528511）

醬油是一種美味的傳統調味品，兩千多年前古代中國人民就掌握了醬油的生產釀造方法，從此以后它與人們的生活息息相關。醬油發酵是一個多種類微生物（包括霉菌、酵母、細菌等）共同對大豆和小麥等原料進行天然發酵的過程。經過微生物及其所產酶系的長期、共同作用，使得醬油具有獨特的風味和豐富的營養價值[1]。

微生物群落組成對于醬油的發酵過程和風味物質合成具有重要影響，傳統醬油發酵過程中微生物的多樣性賦予其獨特的酯香味和醬香味，然而醬油中食鹽、酒精等物質含量較高，嚴重威脅微生物生長，本文總結了近年來國內外對醬油抗逆微生物的分離鑒定成果，希望為醬油的創新研究工作提供思路，為擴充醬油釀造微生物種質資源庫和改善醬油風味提供幫助。

1 醬醪中的主要微生物

從醬油生產中分離得到的微生物種類繁多，主要有霉菌、酵母菌以及細菌（主要是乳酸菌）3大類。醬油制曲階段主要是霉菌（最主要是米曲霉Aspergillus oryzae）起作用，它在醬油釀造中起到重要作用。酵母菌在醬油發酵過程中主要起增香作用，由此增加了醬油風味。乳酸菌能產生大量的有機酸。有機酸的大量存在不僅對有害微生物的生長有一定的抑制作用，同時為魯氏接合酵母的生長繁殖提供條件，而且這些有機酸既是醬油的風味成分，又是其他酯香類物質的前體，極大地豐富了醬油風味[2]。

近年來，有國內外學者通過宏基因組學等分子生態學的方法研究了醬醪中微生物的結構組成，發現還有大量其他未被報道的微生物，尤其是大量的細菌參與醬油發酵。研究結果顯示，這些細菌的種群總量多、豐度大，但是它們在醬油生產中具有的特性和功能尚不十分清楚[3]。

我國目前的醬油生產商品化菌種資源相對匱乏，無法解決隨著生活水平的提高，人們對醬油產品個性化的需求和健康、天然的品質要求也在逐漸增加這一矛盾[4]。而對于研究者而言，就應該不斷去發現醬油生產過程中的微生物以及探究它們在發酵過程中的功能角色。

2 依賴于傳統培養的方法分離醬油抗逆微生物

綜合前期的研究發現，早期醬油抗逆微生物的分離鑒定研究重點在于霉菌和酵母，而對生產過程中存在的耐鹽細菌研究相對較少[5]。近年來，隨著國內外學者對醬油生產中微生物群落結構研究的逐步深入，發現其中的微生物不僅生物量大而且種類豐富，然而它們在醬油高鹽逆境中具有的功能有待進一步研究。目前國內外學者不斷報道分離自醬油抗逆微生物以及它們的生物學功能，這對醬油生產微生物菌種庫的擴充、對其他進行類似研究的學者們是一種鼓勵。

2.1 抗逆細菌

表1對近年來國內外學者從醬醪中分離鑒定的微生物進行了統計。

表1 醬油發酵過程中分離鑒定的耐鹽微生物表

從表1各文獻中可以看出，不同產地、不同生產方法、不同發酵時間、甚至是不同批次的醬醪中分離得到的抗逆細菌是不盡相同的。各地學者分離鑒定到的抗逆細菌有Weissella（W. paramesenteroides）、Pediococcus（P. halophilus、P. acidilactici、P. pentosaceus）、Staphylococcus（Staph. kloosii、Staph. gallinarum、Staph.condimenti、Staph. cohnii、Staph. vitulus、Staphy. saprophyticus、Staph. epidermidis、Staph. xylosus）、Tetragenococcus（T. halophilus）、Enterococcus（E. faecium）、Bacillus（B. amyloliquefaciens、B.licheniformis、B. pumilus、B. subtilis、B. sonorensis、B. cereus、B. methylotrophicus）、Micrococcus、Aerococcus、Lactobacillus（L. fermentum、L. acidipiscis、L. farciminis、L. pentosus、L. plantarum）、Delftia（D.tsuruhatensis）和coryneform bacteria等。其中大多數分離到的抗逆微生物均未能考察其在醬油生產中的功能。YANG[7]、謝小保等[9]分別對中國醬油、WEI等[19]對中國醬油、TANASUPAWAT等[15]對泰國醬油中的耐鹽細菌做了系統性的分離鑒定工作。另外國內的研究機構江南大學近些年也不斷有相應的研究成果 報道。

在醬油中被廣泛報道的細菌有乳酸菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等。乳酸菌包括魏斯氏菌屬（Weissella）等[21]，它是一類能利用各類糖類化合物作為產物生成底物乳酸的細菌的總稱，醬油發酵中的乳酸菌通常還具有耐受高鹽（至少8%，見表1）這一普通乳酸菌不具備的性質，通過在發酵環境中產生有機酸及分泌肽類物質，如抑菌肽，將醬醪體系轉變為偏酸的環境，能在一定程度上抑制雜菌的生長，有利于一些酵母的生長及代謝。

趙國忠等[13]將從老廠醬醪中分離到的一株耐鹽植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）添加到醬油發酵中，氣相色譜-質譜檢測結果顯示添加了這株植物乳桿菌后，發酵醬油中酮類、酚類和醇類等物質增加顯著。另外，該醬油總酸、氨基態氮、可溶性無鹽固形物這3項指標都有顯著提高，其中包括乳酸含量，而其他有機酸含量略有下降。同時結果表明該植物乳桿菌可促進生成更多的單糖、氨基酸、乳酸等小分子化合物，從而增強醬油的風味。此研究為今后醬油的品質改良打下良好的理論基礎。

傳統發酵食品中魏斯氏菌廣泛存在，具有較高的應用價值。胡傳旺[6]通過對高鹽稀態醬油中耐鹽細菌的代謝產物進行分析時發現魏斯氏菌在高鹽（18%）培養條件下均能水解原料，產生較多的鮮味氨基酸。李巧玉等[12]發現，12株從醬油中得到的魏斯氏菌在高鹽培養條件下，有1株可降解利用多種生物胺，有3株菌反而會產生生物胺，不過大多數菌株不產生物胺。另外結果顯示這12株魏斯氏菌在高鹽體系中均能生成多種有機酸和多種胞外多糖等功能性物質，從而改善醬油的口感和營養。

楊怡敏[22]發現乳酸足球菌（Pediococcus acidilactici） BBE 1120能夠積累瓜氨酸，而且正是因為高鹽環境、碳源種類及濃度等因素引起該微生物積累瓜氨酸，其中高鹽是最主要因素。通過比較不同來源的乳酸足球菌菌株，發現這些乳酸足球菌在18%鹽濃度條件下，利用底物精氨酸生成產物瓜氨酸的轉化率是有差異的，對高鹽耐受性強的菌株的轉化率相對較低。作者分別對不同菌株產生物胺的能力進行了定性和定量分析，結果表明該菌不產測定的8種生物胺。此外通過分析發現，乳酸足球菌能夠在高鹽環境下降解8種生物胺。

胡傳旺[6]發現嗜鹽四聯球菌（T. halophilus）不僅會產生大量的有機酸，而且還會產生較多的揮發性物質。楊希飛[23]發現嗜鹽四聯球菌可代謝瓜氨酸（它是由精氨酸脫亞氨酶途徑產生）和氨基甲酸乙酯。接入嗜鹽四聯球菌對于醬油風味的提升有意義，而且醬油中的各類風味物質（酸、醛、酮、酯、酚和吡嗪類等物質）的含量也分別比對照提高不少。

另外葡萄球菌作為風味細菌在發酵肉制品中應用較多，其本身具有很強的耐高鹽能力，容易馴化。胡傳旺等[24]從醬油中分離得到一株葡萄球菌JY09，其產生的揮發性物質較多。

芽孢桿菌的蛋白酶及淀粉酶一般酶活較高，有利于醬油中蛋白質及淀粉的分解。PALANIYANDI等[25]從韓國醬油（Ganjang）中分離到了一株索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），發現其產胞外多糖的能力突出，可抑制一些病原微生物的生長，可以作為益生菌，但該研究未對其在醬油發酵中的功能進行考察。JIANG等[8]從天然曬露法釀制醬油中分離鑒定了一株耐鹽枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），發現其在醬油發酵過程中具有改善醬油香氣的作用，香氣成分中的酚、酮、酯均有不同程度的增加。

醬油風味細菌的研究起步較晚，在生產中的應用程度較淺。此外，尚有許多風味細菌未被應用或發現，這需要此領域內的學者們進行更加深入的研究。

2.2 抗逆酵母

Candida（C. parapsilosis、C. etchellsii、C. guilliermondii var. membranaefaciens、C. famata、C. pulcherrima、C. lusitaniae、C. orthopsilosis）、Debaromyces（D. hansenii var. fabryi）、Sterigmatomyces、Meyerozyma（M. guilliermondii）、Torulopsis、Saccharomyces、Trichosporon、Cryptococcus（C. albidus）、Microbotryum（M. violaceum）、Pichia（P. guilliermondii、P.sorbitophila）、Rhodotorula（R. mucilaginosa、R. glutinis）、Tetrapisispora（T. blattae）、Torulaspora（T.delbrueckii）、Wickerhamomyces（Wickerhamomyces. anomalus）等酵母得到了分離鑒定。其中，馮杰[14]將分離到的C. etchellsii添加到醬油的發酵生產中，發現它對于醬油的質量和風味具有顯著的促進作用。結果表明，氨基態氮和可溶性無鹽固形物含量分別達到（9.15±0.12）g·L-1和（269.60±3.15）g·L-1，相較于對照分別增加了23.1%和17.6%。樣品中最高的游離氨基酸含量和39種揮發性風味化合物總量分別達到（58.21±1.77）g·L-1和（17.81±0.45）g·L-1，相較于對照分別提高了1.76%和178.7%。醬油中的典型風味物質，如4-乙基愈創木酚和HEMF等物質均有所增加，更好地促進了醬油風味質量的改善和提高。

YANG等[7]和ARYUMAN等[16]兩個不同的團隊各自從醬油中分離到了季也蒙念珠菌（Meyerozyma guilliermondii）這類耐鹽酵母。YANG等還從醬油中檢測出10種特征香氣成分，包含醛、酮、醇、酸和酯等不同的化合物，這10種化合物中主要的、能夠為醬油的特征風味帶來積極影響的揮發性物質分別為2-苯基乙醇和3-甲基-1-丁醇。而ARYUMAN等分離到的季也蒙念珠菌還能產生谷氨酰胺酶，而且酶活隨著鹽濃度的增大而增大，在18%高鹽濃度下達到最大，可見高鹽環境下該酵母可以使底物L-谷氨酰胺生成產物L-谷氨酸的水解反應加速，對醬油產品鮮味的提升具有重要作用。因此兩個團隊均認為該類酵母具有進一步添加到醬油生產中去提升醬油品質的 價值。

3 結語

長期以來人們對傳統食品發酵行業的基礎研究不夠重視，對醬油生產中的抗逆微生物分離、鑒定、選育方面的研究相對滯后，尤其是對其中的細菌的研究相對較少，這不利于研究醬油發酵體系中的微生物群落組成以及各自的角色功能。但隨著生活水平的不斷提高，人們對高品質醬油的需求也越來越大。這也為醬油釀造行業帶來了新的發展契機。

消費者對醬油品質的追求促進了高品質醬油釀造工藝的發展，醬油抗逆微生物的研究及其應用成為推動工藝發展的重要途徑，也將成為研究的熱點之一。各種耐鹽細菌與主發酵菌種在長期發酵中相互作用，代謝產生的各種物質相互反應，構成了醬油復雜的風味物質體系，從而形成了醬油特有的風味。隨著高通量測序、基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學等現代生物技術的應用，深入研究醬油抗逆微生物、擴大其應用優勢、發掘其在釀造中的應用潛力、實現多菌種混合發酵及優化醬油風味，將為生產安全健康、鮮咸適口、醬香醇厚的優質醬油提供有力保障。