液相色譜-質譜/質譜法測定雞蛋粉中 喹諾酮類藥物殘留

◎ 張 威，胡婷婷，秦培余，姜 珊，陳 露，劉晨曦，劉婉秋

（吉林省遼源市食品質量安全檢測中心，吉林 遼源 136200）

隨著時代的發(fā)展，消費者對食品的要求已不再局限于簡單的維持生命和果腹，對食品的安全、營養(yǎng)和滋味提出了更高的要求[1]。隨著人們生活節(jié)奏的加快，方便、營養(yǎng)、快捷的食品更加受到人們的追捧。而雞蛋粉的出現正好滿足了人們的這一需求。

現行有效的國家標準未對雞蛋粉中獸藥殘留檢測方法作出具體的要求。因檢測方法的不足，不合格的雞蛋粉產品在市場中大肆流通。液相色譜-質譜/質譜法可根據被測物（雞蛋粉）的特征離子、保留時間等結構信息，以較高的靈敏度和選擇性，準確判定待測物是否為陽性，避免了假陽性樣品的檢出[2]。該方法的確立從傳播途徑上減少了殘留現象，彌補了我國在雞蛋粉中喹諾酮類藥物殘留檢測方法的空缺，為市場監(jiān)督執(zhí)法部門對市售及出口雞蛋粉的監(jiān)督管理提供了科學的數據保障，規(guī)范了養(yǎng)殖戶的行為，對于從源頭上控制抗生素的使用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

液相色譜-質譜/質譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）（美國AB SCIEX公司）；天平：感量為0.01 g（YP202N）和0.000 1 g（BSA124S-CW）；高速大容量冷凍離心機：6 000 r·min-1（TG20KR-D）；渦旋混合器（QL-8665，6）；氮吹儀（TTL-DCII）。

1.2 材料與試劑

喹諾酮類混合標準對照品（濃度：100 mg·L-1，體積：1 mL，編號：IST47508-100M），包括恩諾沙星（CAS號：93106-60-6）、環(huán)丙沙星（CAS號：85721-33-1）、諾氟沙星（CAS號：70458-96-7）、培氟沙星（CAS號：6159-55-3）、沙拉沙星（CAS號：98105-99-8）、洛美沙星（CAS號：98079-51-7）、依諾沙星（CAS號：74011-58-8）和氧氟沙星（CAS號：82419-36-1）；甲酸（安譜，CAS：64-18-6）；乙腈（色譜純fisher）；凈化管（Wondapak QuEChERS P/N5010-015204）；色譜柱（島津Shim-pack GIST C18100 mm×2.1 mm，2 μm P/N227-30001-04）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

（1）提取。稱取2 g（精確至0.01 g）雞蛋粉樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 2%甲酸乙腈渦旋30 s，超聲提取10 min后，于6 000 r·min-1離心10 min，上清液待凈化。

（2）凈化。取上清液2 mL于QuEChERS SPE凈化管中，渦旋30 s，于6 000 r·min-1離心5 min，取上清液1 mL，于40 ℃水浴氮氣吹至近干，加入1 mL 0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液（9+1）定容，超聲波振蕩5 min，過0.2 μm微孔濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

（3）標準溶液配制。準確量取8種喹諾酮類混合標準對照品1 mL，用乙腈溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1.0 μg·mL-1的標準儲備液。將標準儲備溶液逐級稀釋成濃度為1.0 μg·L-1、 5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、25.0 μg·L-1、 50.0 μg·L-1和100.0 μg·L-1的8種喹諾酮類藥物標準工作溶液，現用現配。

1.3.2 色譜條件

流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫條件參見表1；流速：0.1 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃。

表1 梯度洗脫條件表

1.3.3 質譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：正離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM）；電離電壓：5.5 kV；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力（CUR）：10 psi；霧化氣壓力：50 psi；輔助氣壓力：50 psi；定性離子對、定量離子對、去簇電壓、碰撞能量見表2。

表2 8種喹諾酮類藥物定性離子、定量離子、去簇電壓、碰撞能量、保留時間表

續(xù)表2

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑優(yōu)化

分別使用0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、2.0%甲酸乙腈、5.0%甲酸乙腈以及0.5%甲酸甲醇、1.0%甲酸甲醇、5.0%甲酸甲醇和10.0%甲酸甲醇作為提取溶液對雞蛋粉中的8種喹諾酮進行提取，發(fā)現8種喹諾酮藥物不溶或者微溶于甲醇，而蛋白質在甲醇中的溶解性較強，乳化現象嚴重，提取效果不明顯，回收率較低。乙腈能使蛋白質變性[3]，有利于目標化合物的提取，加入一定濃度的酸化乙腈溶液可以有效提取目標化合物，同時沉淀蛋白[4]，大大提高提取率。但酸的濃度過高，也會發(fā)生嚴重的乳化現象。因此，比較了響應值的強度及回收率，最終確定提取溶液的濃度為2.0%甲酸乙腈。不同濃度甲酸乙腈提取液提取效果見圖1。

圖1 不同濃度甲酸乙腈提取液提取效果圖

2.1.2 凈化裝置的優(yōu)化

固相萃取是常用的獸藥殘留檢測的有效方法[5]。有研究表明，酸化乙腈的提取液未凈化會導致較強的基質效應[6-7]，而EDTA-Mcllvaine緩沖液由于提取液混濁而導致固相萃取柱堵塞[8]，從而使回收率大大降低。考慮雞蛋粉是粉狀物質，基質復雜，蛋白質含量較高，QuEChERS SPE凈化管可完全避免堵柱現象的發(fā)生，本次試驗選用QuEChERS SPE凈化管，減少了洗滌溶劑的時間，提高了凈化效果。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

8種喹諾酮化合物的極性相似，因此梯度較大的流動相比例不利于化合物在色譜柱中的分離，比較了近60種不同梯度的流動相，結合響應值的強度，回收率、保留時間等因素，最終確定流動相中的有機相為0.1%甲酸乙腈溶液，無機相為0.1%甲酸水溶液。洗脫條件如表1所示。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

將8種喹諾酮混合標準物質用乙腈稀釋至濃度0.2 mg·kg-1，以20.0 μL·min-1的流速注入質譜儀，在ESI+模式下進行Q1掃描，確定母離子。再進行MS2掃描，依據不同的碰撞能量和去簇電壓，選擇響應值最強的兩對離子作為子離子，最后確定8種喹諾酮化合物的MRM條件，見表2。

2.4 線性關系、方法檢出限、回收率

將8種喹諾酮類藥物標準工作溶液，按照上述色譜和質譜條件測定，外標法定量。得到8種喹諾酮化合物的線性關系均大于0.999，線性關系良好。根據特征質量色譜峰的信噪比S/N≥3所對應的濃度作為本方法的檢出限，8種喹諾酮的方法檢出限均為 1.0 μg·kg-1。8種喹諾酮化合物的線性關系見表3。

表3 8種喹諾酮類化合物的線性方程及相關系數表

在空白雞蛋粉中添加0.01 mg·kg-1，0.02 mg·kg-1， 0.10 mg·kg-13個濃度水平的對照品溶液，每個濃度平行測試6次?；厥章试?3.2%～102.0%，RSD小于23%，滿足獸藥殘留檢測的要求（見表4）。

表4 8種喹諾酮化合物在雞蛋粉中不同添加濃度回收率、RSD表（n=6）

3 結論

本研究建立了雞蛋粉中8種喹諾酮類藥物殘留的液相色譜-質譜/質譜法。該方法靈敏度高，準確性好，操作簡便，經濟投入較低，可以滿足企事業(yè)等檢測機構對獸藥殘留檢測的需要。