箱線圖在山梨酸定量測定能力驗證結果 分析中的應用

◎ 姚澤平，黎佩錦，蔡若純，蔡海華，林騰奕，劉小玉

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

箱線圖，又稱箱圖、箱形圖、箱絲圖、盒須圖和盒式圖，是一種直接表現變量分布情況的統計模型圖形，利用它可以以較為直觀的視角觀察數據的分布情況，箱線圖對于顯示變量的分布情況并確定離群值的位置非常有用[1-2]。箱線圖技術是將數據集以四分位數的形式拆分，通過找到中位數的上四分位數、下四分位數以剔除數據集中的異常值[3]。箱線圖中的中位數、四分位間距是箱線圖用來顯示數據中心和分布的元素[4]。除了箱線圖，檢驗樣本數據中異常離群值的常用方法還有3σ法、格拉布斯法等。相比之下，箱線圖可以應用于正態分布樣本數據異常值判斷，也可以應用于非正態分布樣本數據異常值判斷。因此，箱線圖在統計分析中已得到廣泛應用，THIRUMALAI等[5]應用箱線圖分析肺癌數據；代斌[6]應用箱線圖法的PSO-SVM研究小麥種子的分類；LIN等[7]應用箱線圖挖掘RBM8A在肝細胞癌中的表達及基因調控網絡；趙穎祺等[8]提出一種基于箱線圖的SAR圖像艦船研究的檢測算法；谷劍芳[9]應用LSTM、RFM算法和箱型圖探討了電子社保卡在互聯網中的行為。

山梨酸是一種食品添加劑，是目前在國際上使用較為廣泛的防腐劑。它有較強的抑菌作用，能夠阻止真菌的繁殖生長。山梨酸具有抑制微生物內部脫氫酶系統的特性，通過抑制脫氫酶系統阻止微生物的生長繁殖，從而起到防腐的作用，常在藥品、化妝品、動物飼料、橡膠助劑以及包裝材料中得到應用[10-11]。我國GB 2760—2014對不同類別食品中山梨酸的限量作出了明確規定[12]。

能力驗證是一種通過實驗室間的比對，按照標準準則評估參與者能力的活動[13]。能力驗證活動可評估實驗室特定的檢驗測量能力，進一步發現實驗室存在的不足，建立檢驗方法的可比性和有效性，促進實驗室提升檢驗測量質量，有助于所參與實驗室提高檢測能力[14]。因此，參加能力驗證項目的結果值能反映實驗室的檢測水平。在能力驗證活動中，參與機構除了具有一定的檢驗檢測水平，對于檢驗結果的分析確定也應值得重視。

為進一步提高實驗室對食品中山梨酸的定量測定檢測水平，實行實驗室內部質量控制計劃，本實驗室參加了2020年度FAPAS 20172“巧克力蛋糕中的山梨酸”能力驗證活動，通過建立一種箱線圖分析流程圖，確定樣品中山梨酸含量值。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲醇（HPLC，4 L，默克）、乙酸銨（HPLC，500 g/瓶， FISHER）、實驗用水（電導率為0.55 μS·cm-1，25 ℃，均通過Milli-Q超純水機制備）、亞鐵氰化鉀（分析純，500 g，廣試）、乙酸鋅（分析純，500 g，廣試）；標準物質：山梨酸標準品（CAS：110-44-1，500 mg，CATO）；色 譜柱：Waters XBridge C18，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 儀器與設備

萬分之一電子天平（瑞士梅特勒LE303E）；10 mL容量瓶（天玻，A級）；50 mL容量瓶（天玻，A級）；100 mL容量瓶（天玻，A級）；Milli-Q Advantage A10型超純水機（德國Merck公司）；超聲系統（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；高效液相色譜儀（美國沃特世ACQUITY ARC）；移液器（100 μL、1 mL、5 mL）。

1.3 實驗方法

1.3.1 箱線圖分析流程的建立

在能力驗證活動中，能力驗證提供者可采用經典的統計方法來確定能力驗證樣品的標準值和標準差。能力驗證提供者可采用格拉布斯準則來剔除離群值后計算樣本的均值和標準差，以均值作為標準值，以標準差作為能力評定標準差；也可以采用穩健統計方法。穩健統計方法在能力驗證實際活動中應用更加廣泛，更加靈活，不需要剔除樣本數據中的離群值[15-16]。而對于能力驗證活動參加者，能力驗證樣品的含量值如何確定卻沒有相關的標準文獻。能力驗證參加者在實際能力驗證活動過程中，往往采用多種質控措施，如人員比對、儀器比對、方法比對、質控樣試驗和加標回收等[17]，以提高實驗數據的準確性，這樣可得到多組實驗原始數據。然而，質控樣試驗、加標回收率，變異系數等指標，對組內數據中是否存在異常值并不敏感。因此，可從整體考慮分析所有數據，運用箱線圖尋找剔除數據樣本中的離群值，減少結果的偏離程度。最后根據樣本數據的分布類型選擇合適的集中趨勢特征值作為含量值。箱線圖具體分析流程如圖1所示。

圖1 箱線圖分析流程圖

1.3.2 溶液的配制

（1）乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）配制。準確稱取乙酸銨1.54 g于燒杯中，加入適量水溶解后轉移定容至1 L，經0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。

（2）山梨酸標準儲備溶液（1 000 mg·L-1）配制。準確稱取山梨酸標準品0.100 g（精確至0.000 1 g），用水溶解定容至100 mL容量瓶中，于4 ℃貯存。

1.3.3 樣品前處理

準確稱量約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL離心管中，加入超純水約25 mL，充分渦旋，混合均勻，置于50 ℃水浴中超聲20 min，冷卻至室溫，依次加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2 mL，搖勻，離心5 min， 將水相轉移至50 mL容量瓶中，于離心管殘渣中加入20 mL超純水，重復提取一次后將水相轉移至同一 50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。吸取適量上清液，0.22 μm濾膜過濾，濾液待液相色譜測定。

1.3.4 標準曲線濃度范圍和樣品稀釋倍數

20172樣品進行預實驗，用GB/T 5009.28—2016（第一法）測得樣品的山梨酸含量水平在700～900 mg·kg-1， 其儀器讀取濃度在28～36 mg·L-1。再結合加標濃度考慮，樣品溶液最大濃度可到75 mg·L-1。故標準系列濃度為1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、 50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1。

1.3.5 質量控制措施

為進一步提高實驗數據的準確性，本次參加的能力驗證活動，根據20172 試樣的山梨酸的含量水平、實驗儀器、方法選擇以及本實驗室的條件，對山梨酸的含量測定使用以下質量控制措施，即平行實驗、加標回收實驗、質控樣品實驗、儀器比對和人員比對。質量控制措施的具體實施內容如下。

（1）精密度實驗。采用7平行測定，即稱取7份樣品進行測定分析，計算平行結果的變異系數，分析每組測定結果的精密度。共3名實驗人員，每人均進行7次平行測定。

（2）加標回收實驗。加標水平一般為樣品含量水平的0.5～2.0倍，而20172樣品的山梨酸含量水平為700～900 mg·kg-1，所以合適的加標水平為 450～1 400 mg·kg-1；取樣量按2.0 g來計算，以此對應的樣品加標量為0.9～2.8 mg。本實驗以16 mg為實際加標量進行加標回收實驗，通過測定并計算加標回收率來分析實驗結果的準確性。共3名實驗人員，每人均進行2次加標回收實驗。

（3）質控樣品實驗。本次實驗選用山梨酸含量與20172樣品比較接近的蛋糕中的山梨酸質控樣品（ZKY2930，基質：巧克力蛋糕50 g）進行測定，評估能力驗證樣品測定過程中的準確性。共3名實驗人員，每人均進行2次質控樣品實驗。

（4）儀器比對和人員比對。比對實驗根據實驗室條件，對美國沃特世（ACQUITY ARC）以及日本島津（Prominence UFLCXR）兩種不同品牌的儀器進行比對實驗，對GB/T 5009.28—2016（第一法）進行不同實驗人員間的測定結果比對。運用實驗人員間的比對實驗，以確保實驗人員、檢測方法和儀器性能的可靠性。

2 結果與分析

2.1 精密度實驗結果分析

稱量7份20172樣品按以上實驗方案進行測定，結果見表1。GB/T 27404—2008要求1 000 mg·kg-1含量水平的實驗室內變異系數為3.8%[18]，本次實驗3組人員測定結果的變異系數都小于3.8%，均符合GB/T 27404— 2008的要求。從變異系數結果分析，無法判斷各組實驗人員的測定結果是否存在異常值。

表1 精密度實驗結果表

2.2 加標回收與質控樣品實驗結果分析

稱取兩份20172樣品，加入適量山梨酸標準儲備溶液，前處理測定步驟與樣品一致，計算加標回收率。稱取山梨酸質控樣品ZKY2930與20172樣品同時進行前處理和上機測定。加標回收率與質控樣品的測定結果如表2所示。由表2可知，3組人員的質控樣品實驗均為滿意。GB/T 27404—2008要求1 000 mg·kg-1含量水平的加標回收率為95%～105%，實驗人員B有一個加標回收率為92.1%，小于95%，不滿足 GB/T 27404—2008的要求。加標回收率過低有可能是該次加標實驗操作存在異常，也有可能是因為實驗人員B的平行測定實驗結果偏高，從加標回收與質控樣品實驗結果無法確定原始數據是否存在異常值。

表2 加標回收與質控樣品實驗結果表

2.3 箱線圖結果分析

用Origin 2018將精密度實驗原始數據看作一個整體繪制箱線圖，如圖2所示。由圖2可知，實驗人員B有一個原始數據864為離群值，故將其剔除。

圖2 山梨酸原始數據箱線圖

將剔除異常值后的數據再次繪制箱線圖判斷是否有離群值，此時已無離群值，詳見圖3。

圖3 山梨酸處理數據箱線圖

2.4 山梨酸含量的確定

剔除異常值后原始數據還有20個，假設樣本數據來自正態總體，且樣本量N較小（3≤N≤50），故采用Shapiro-Wilk的W統計量檢驗原始數據的正態性[19]，計算得到P=0.079＞0.05，不拒絕原假設，認為數據總體呈近似正態分布。由于樣本數據為正態分布，故在集中趨勢特征值中，選取平均值為816 mg·kg-1作為山梨酸的含量值。

2.5 山梨酸含量的評價

本次FAPAS能力驗證07300共計42家實驗室參與，其中有33家實驗室參與了山梨酸結果統計，山梨酸含量的指定值為837 mg·kg-1，本實驗室最終結果值為816 mg·kg-1，Z值為-0.4（圖4，實驗室代碼為38）， 能力驗證結果滿意。

圖4 FAPAS 20172中山梨酸的Z值分布柱狀圖

3 結論

在本次能力驗證中，對20172樣品的山梨酸含量測定結果為816 mg·kg-1，Z值為-0.4，結果滿意。實驗數據表明，對于能力驗證樣品山梨酸含量的測定結果，通過建立箱線圖分析流程可以分析原始數據的離群情況，選取合適的集中趨勢特征值確定為含量值，使結果更加準確。該方法準確、可靠，可為能力驗證結果評估提供一種分析方法。