膠體金免疫層析法檢測帶魚中氯霉素殘留的前處理方法研究

◎ 李 倩，陳 煜，閻安婷

(山西省檢驗檢測中心藥品檢驗技術(shù)研究所，山西 太原 030001)

帶魚，自古以來就是我國重要的海洋作物之一，在《本草從新》《中華本草》等著作中均有記載。帶魚蛋白含量高，味道鮮美，具有補中益氣、溫胃養(yǎng)肝、補氣血的作用[1]。

氯霉素為廣譜抗生素，價格低，療效顯著，多用于動物的抗菌治療預(yù)防。氯霉素理化性質(zhì)穩(wěn)定，不容易分解，會在人體中蓄積，從而引發(fā)血液系統(tǒng)疾病及抗藥性。我國已明確規(guī)定禁止氯霉素在食品動物中使用[2]。氯霉素殘留現(xiàn)有檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法等[3-4]，但這些方法前處理復(fù)雜，需要大型檢測設(shè)備。膠體金免疫層析法操作簡便快速，又具有很好的特異性，無需昂貴的檢測儀器[5-7]。本實驗通過優(yōu)化前處理方法，建立以膠體金免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)的帶魚中氯霉素殘留快速檢測方法，該方法的建立為其他動物藥物殘留的快速檢測提供有利的技術(shù)支持，對于今后開展基層食品藥品檢驗檢測工作也具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

帶魚購自太原美特好超市；固相萃取小柱（Cleanert Silica，200 mg/6 mL，LOT：0170198）；氯 霉 素 快速檢測卡（蘇州快捷康生物技術(shù)有限公司，批號：kjk20171125c）。氯霉素，購于Dr. Ehrenstorfer，CAS登錄號為56-75-7；乙酸乙酯、水、正己烷、丙酮、乙腈、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）及氯化鈉均為分析純。

Eppendorf移液器、中佳HC-3018高速離心機、IKA V2S025渦旋混合器及梅特勒-托利多ML204T電子天平。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

稱取氯霉素用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.01 μg·mL-1的氯霉素標準工作液。臨用新配。

1.2.2 前處理方法研究

取粉碎均勻的帶魚樣品6 g于50 mL具塞離心管中，分別采用以下4種方法進行樣品前處理。

方法一：加入8 mL乙酸乙酯，渦旋提取5 min，以8 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移全部乙酸乙酯層 40 ℃氮氣吹干，置于15 mL具塞離心管中，精密加入600 μL復(fù)溶液，渦旋混合1 min，作為待測液。

方法二：依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯，提取同方法一。精密加入600 μL復(fù)溶液和600 μL正己烷，渦旋混合1 min，取下層溶液作為待測液。

方法三：依次加入15 mL乙腈勻漿提取，加入 10 mL乙腈飽和的正己烷去脂，離心分層，取乙腈層用氮氣吹干，加入5 mL丙酮-正己烷（1∶9）溶解殘渣待凈化。過LC-Si硅膠小柱，用5 mL丙酮-正己烷（6∶4）洗脫，收集洗脫液用氮氣吹干，復(fù)溶為待測液。

方法四：依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯，渦旋提取5 min，以4 000 r·min-1離心5 min。轉(zhuǎn)移乙酸乙酯層于50 mL具塞離心管中，加入正己烷25 mL，氯化鈉1 g渦旋混勻，4 000 r·min-1離心1 min，上清液待凈化。凈化同方法三，復(fù)溶為待測液。

1.2.3 復(fù)溶液的確定

通過查閱資料并結(jié)合試劑盒復(fù)溶液的pH值范圍選擇最常用的4種磷酸鹽緩沖液。

稱取0.12 g磷酸二氫鈉置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液A；稱取7.16 g磷酸氫二鈉置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液B。①取溶液A 3.3 mL、溶液B 6.7 mL、 氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液1（pH 7.1）。②取溶液A 2.8 mL、溶液 B 7.2 mL、氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液2（pH 7.2）。③取溶液A 2.3 mL、溶液B 7.7 mL、氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液3（pH 7.3）。④取溶液A 1.9 mL、溶液B 8.1 mL、氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液4（pH 7.4）。

1.2.4 測定步驟

吸取150 μL樣品待測液滴加到檢測卡上的加樣孔中，室溫溫育5 min，通過比較控制線、檢測線的顏色深淺對結(jié)果進行判定。

1.2.5 測定條件研究

本方法的結(jié)果測定以競爭性免疫層析為基礎(chǔ)，具有特異、靈敏、快速以及操作簡便等優(yōu)點，但其對反應(yīng)條件及環(huán)境往往具有嚴格的要求，本方法除了對反應(yīng)體系進行優(yōu)化，還對測定時間和溫育溫度進行研究。測定時間分別考察了復(fù)溶后0 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min測定效果，溫育溫度對比了18 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下的反應(yīng)效果。

1.2.6 交叉反應(yīng)

分別取甲砜霉素、氟甲砜霉素，制成水平為 10 ng·mL-1的標準溶液，按照本方法進行實驗，考察試劑盒與上述化合物的交叉反應(yīng)。

1.2.7 與參比方法一致性分析

稱取空白樣品帶魚為基質(zhì)，分別添加3個濃度水平0 μg·kg-1、0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1的盲樣各40份，其中20份按自擬方法的前處理和分析步驟進行測定，另外20份參考《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）測定，對比兩種方法測定結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法及復(fù)溶液確定

2.1.1 對前處理方法進行考察

對比4種前處理方法發(fā)現(xiàn)，方法一樣品加乙酸乙酯后，樣品凝結(jié)成塊，提取過程中不能均勻分散，提取不完全，待測溶液渾濁不清，無法點樣；方法二加入水后樣品結(jié)塊問題解決，但加入的正己烷量太少，無法完全去脂，待測溶液依舊渾濁不清；方法三雖然待測溶液可以達到滿意的結(jié)果，也消除了脂肪對檢測結(jié)果的干擾，但乙腈氮吹耗時過長，無法滿足快檢要求，需進一步優(yōu)化，縮短檢測時間；方法四試驗樣品中添加25 mL正己烷后，待測溶液清晰，點樣結(jié)果滿意，同時乙酸乙酯氮吹時間縮短，單樣時間控制在 60 min之內(nèi)。因此，采取方法四為本試驗最終方法。

2.1.2 對復(fù)溶液進行考察

如圖1所示，磷酸鹽緩沖液2（pH 7.2）廠家試劑盒能達到較好的點板效果。

圖1 測試結(jié)果圖

2.2 測定條件研究結(jié)果

結(jié)果表明，在1.2.5各不同時間段下，待測液點板后T線顏色沒有明顯差異，時間的延長對本實驗的測定結(jié)果沒有影響，但是為了避免不確定因素對實驗的影響，建議復(fù)溶后立即測定。在1.2.5各溫度下，待測液點板后無明顯差異，溫度對本試驗的測定結(jié)果幾乎沒有影響，但是為了避免極端監(jiān)測環(huán)境對于檢測相關(guān)各個環(huán)節(jié)的影響，建議日常檢驗中在室內(nèi)或相對溫和的檢驗環(huán)境中進行，故本方法中孵育溫度建議為室溫。

2.3 交叉反應(yīng)結(jié)果

交叉反應(yīng)顯示，甲砜霉素、氟甲砜霉素與試劑盒點板后結(jié)果均顯示陰性，表明均無交叉反應(yīng)。

2.4 與國標方法對比結(jié)果

表1、表2的檢測結(jié)果表明，膠體金方法中0 μg·kg-1均未檢出為陰性，0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出為陽性。液相色譜-質(zhì)譜法中0 μg·kg-1檢出濃度為 0 μg·kg-1視為陰性，0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出符合回收率要求（80%～110%）的濃度視為陽性，因此膠體金試劑盒方法的結(jié)果均與參比方法一致，符合方法一致性要求。

表1 膠體金免疫層析法檢測結(jié)果表

表2 液相色譜-質(zhì)譜法檢測結(jié)果表

3 結(jié)論

通過優(yōu)化前處理方法、確定復(fù)溶液等操作建立的膠體金免疫層析技術(shù)相比于傳統(tǒng)氣相色譜、液相色譜、酶聯(lián)免疫方法，具有操作簡單快速、特異性強、耗時短、無需大型儀器成本低的特點，非常適合作為初篩手段用于基層現(xiàn)場檢測。