QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定 雞蛋中金剛烷胺和金剛乙胺殘留量

◎ 李巧蓮，劉 鑫，劉 瀛，林 洋，王 韻

（沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽 110136）

隨著人們生活水平的提高，雞蛋作為優(yōu)質(zhì)的高蛋白動(dòng)物源食物，已成為餐桌上不可或缺的食物。因此，雞蛋中獸藥殘留問題引起人們高度關(guān)注。金剛烷胺和金剛乙胺是具有飽和三環(huán)葵胺結(jié)構(gòu)的金剛烷胺類藥物，對(duì)流感病毒、帕金森氏綜合征等病癥有治療作用[1]。金剛烷胺和金剛乙胺可在家禽養(yǎng)殖過程中，用于預(yù)防禽流感和治療早期的禽流感，但是大量的金剛烷胺、金剛乙胺藥物殘留容易引起神經(jīng)系統(tǒng)異常，對(duì)人體造成極大的危害[2-3]。因此，我國原農(nóng)業(yè)部和美國食品藥品監(jiān)督管理局在2005年和2006年先后頒布相關(guān)的公告，命令禁止在畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中使用金剛烷胺、金剛乙胺類藥物[4-6]。但仍有部分養(yǎng)殖場違規(guī)使用金剛烷胺、金剛乙胺等類藥物，由此可見建立一種準(zhǔn)確快速檢測(cè)金剛烷胺、金剛乙胺等類藥物殘留的方法具有重要意義。

目前測(cè)定金剛烷胺和金剛乙胺的方法主要有液相色譜法[7]、氣相色譜法[8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9-10]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。液相色譜法和氣相色譜法劣勢(shì)是靈敏度低、選擇性差、前處理過程煩瑣；酶聯(lián)免疫吸附法易出現(xiàn)假陽性；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其高選擇性、高靈敏度、高通量等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)藥、獸藥殘留的檢測(cè)[12-15]。檢測(cè)雞蛋中金剛烷胺和金剛乙胺的方法常用的有國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中金剛烷胺殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31660.5—2019）[16]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《出口動(dòng)物組織中抗病毒類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 4253—2015）[17]。上述國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是采用N-丙基乙二胺、固相萃取柱進(jìn)行凈化。QuEChERS因其前處理過程快速、簡捷、有效等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在食品藥品安全檢測(cè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[18-21]。本研究用乙腈對(duì)雞蛋樣品進(jìn)行提取，優(yōu)化QuEChERS凈化技術(shù)，配比N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠、石墨化碳黑（PSA-C18-GCB）3種吸附劑對(duì)樣品進(jìn)行凈化，建立一種同時(shí)檢測(cè)雞蛋中金剛烷胺和金剛乙胺殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）分析方法，以期為雞蛋中金剛烷胺和金剛乙胺殘留的分析和監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8050液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；PTY-B620電子天平（感量0.01 g，華志電子科技有限公司）；T10分散機(jī)（德國IKA公司）；MS200多管渦旋混勻儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；H1750R離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Waters 公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)金剛烷胺、鹽酸金剛乙胺、金剛烷胺-D15、鹽酸美金剛-D6（100 mg·L-1，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；無水MgSO4、PSA、HC-C18、GCB（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為高純水。

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1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制金剛烷胺、金剛乙胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 （100 ng·mL-1）：分別精密量取金剛烷胺、鹽酸金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)溶液100.0 μL，置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，-18 ℃避光保存。

配制金剛烷胺-D15、鹽酸美金剛-D6混合同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（100 ng·mL-1）：分別精密量取金剛烷胺-D15、鹽酸美金剛-D6標(biāo)準(zhǔn)溶液100.0 μL，置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，-18 ℃避光保存。

1.2.2 液相色譜條件

C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：水相（A）為0.1%的甲酸水，有機(jī)相（B）為乙腈；洗脫梯度：0～1 min，5%B，1～4 min，5%B→95%B， 4～8 min，95%B，8～9 min，95%B→5%B， 9～11 min，5%B；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子（ESI+）模式電離；多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；霧化氣的流量：3 L·min-1；干燥氣和加熱氣的流量：10 L·min-1；LD的溫度：250 ℃；接口的溫度：300 ℃；加熱塊的溫度：400 ℃。優(yōu)化后定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量（CE）參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)表

1.2.4 樣品前處理

稱取勻漿后的空白樣品5.00 g置于50 mL離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（1.2.1）100.0 μL，加入10 mL乙腈，1 600 r·min-1渦旋提取5 min，在轉(zhuǎn)數(shù)為10 000 r·min-1的離心機(jī)中離心3 min，取上清液。將上述提取過程重復(fù)一次，合并混勻兩次上清液。向15 mL離心管中分別加入150 mg無水MgSO4和3種凈化劑PSA 100 mg、HC-C18100 mg 、GCB 25 mg，再加入4 mL 的上清液，1 600 r·min-1渦旋凈化5 min，在轉(zhuǎn)數(shù)為 10 000 r·min-1的離心機(jī)中離心3 min，取上清液，經(jīng) 0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為獲得金剛烷胺和金剛乙胺最佳質(zhì)譜參數(shù)，利用LCMS-8050液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中的自動(dòng)優(yōu)化模塊，使用100 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1.2.1）進(jìn)行方法優(yōu)化。利用前體離子搜索及產(chǎn)物離子搜索進(jìn)行優(yōu)化，得最優(yōu)質(zhì)譜條件，見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

首先對(duì)乙腈-水和甲醇-水流動(dòng)相體系進(jìn)行考察，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，可得到較好的色譜峰，色譜峰形尖銳對(duì)稱，且出峰附近無明顯的干擾峰，質(zhì)譜響應(yīng)值較高。進(jìn)一步考察在水相中添加甲酸對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響，按0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.5%改變添加甲酸的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水相中添加0.1%甲酸時(shí)，化合物質(zhì)譜信號(hào)明顯增加。但是隨著甲酸添加比例的增大，質(zhì)譜信號(hào)明顯下降，如圖1。因?yàn)檎x子掃描時(shí)，酸性條件下目標(biāo)化合物易于獲取一個(gè)H+形成[M+H]+的分子離子峰，H+過多會(huì)抑制化合物的質(zhì)譜響應(yīng)。綜上，采用梯度洗脫程序，用0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相，對(duì)金剛烷胺、金剛乙胺進(jìn)行分離。圖2為質(zhì)譜和色譜條件優(yōu)化后的MRM色譜圖。

圖1 添加甲酸的比例對(duì)化合物離子化的影響圖（n=3）

圖2 MRM色譜圖（0.5 μg·L-1）

2.3 QuEChERS條件的優(yōu)化

本研究優(yōu)化了QuEChERS技術(shù)，優(yōu)化脫水劑無水MgSO4和N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠、石墨化碳黑（PSA-C18-GCB）3種吸附劑的組合用量。其中無水MgSO4用于吸附試樣中的少量水分，PSA用于吸附有機(jī)酸、脂肪酸、糖類，HC-C18用于吸附脂類等非極性干擾物，GCB能除去色素和固醇類物質(zhì)的干擾。考察無水MgSO4、PSA、HC-C18和GCB用量對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。

稱取空白雞蛋基質(zhì)5.00 g，添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.2.1），使其質(zhì)量濃度為0.5 μg·kg-1，按照1.2.4步驟前處理，取3組每組5個(gè)15 mL的離心管。①如圖3（a）所示，無水MgSO4的添加量（50 mg、100 mg、150 mg、200 mg和250 mg）對(duì)金剛烷胺、金剛乙胺回收率影響不明顯，實(shí)驗(yàn)選擇添加量為150 mg。②添加150 mg無水MgSO4，改變PSA的添加量，如圖3（b）所示，當(dāng)PSA添加量為150 mg時(shí)對(duì)金剛烷胺、金剛乙胺有明顯吸附，選取對(duì)化合物回收率最佳的添加量100 mg。③添加150 mg無水MgSO4和100 mg 的PSA，而改變HC-C18的添加量（25 mg、50 mg、100 mg、150 mg和200 mg），隨著HC-C18添加量的增加，如圖3（c）所示，化合物回收率明顯下降，HC-C18添加150 mg時(shí)吸附明顯，因此選擇HC-C18的添加量為100 mg。④添加不同量的GCB（15 mg、20 mg、 25 mg、50 mg和100 mg），再分別添加無水150 mg MgSO4、100 mg PSA和100 mg HC-C18，當(dāng)添加25 mg的GCB時(shí)，金剛烷胺、金剛乙胺的回收率較高，如圖3（d）。

圖3 凈化填料用量對(duì)化合物回收率的影響圖（n=3）

綜上所述，選確無水MgSO4、PSA、HC-C18和GCB的添加量分別為150 mg、100 mg、100 mg和25 mg。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）普遍存在殘留分析的物質(zhì)中，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與甲醇為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程斜率比進(jìn)行計(jì)算評(píng)價(jià)。計(jì)算方法為 ME=（空白基質(zhì)標(biāo)曲斜率/溶劑標(biāo)曲斜率-1）×100%，當(dāng)ME為正值時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)ME為負(fù)值時(shí)為基質(zhì)減弱效應(yīng)。弱基質(zhì)效應(yīng)為-20%～20%，基質(zhì)干擾程度較低；中等程度基質(zhì)效應(yīng)為-50%～-20%和20%～50%；而ME小于-50%和大于50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，需采取措施補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)[22]。表2結(jié)果表明，金剛烷胺、金剛乙胺為中等基質(zhì)減弱效應(yīng)。為消除基質(zhì)干擾，提高檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，應(yīng)采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線。

表2 基質(zhì)效應(yīng)、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限表（n=3）

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 檢出限、定量限和線性范圍

在空白基質(zhì)中加入一定量的金剛烷胺、金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.2.1）使其濃度分別為0.125 μg·L-1、 0.250 μg·L-1、0.500 μg·L-1、1.250 μg·L-1和2.500 μg·L-1， 按1.2.4步驟進(jìn)行操作，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。在 0.125～2.500 μg·L-1，相關(guān)系數(shù)r為0.999 87、0.999 90， 均大于0.99，線性關(guān)系良好。以信噪比S/N≥3和S/N≥10計(jì)算檢出限和定量限，得到的檢出限和定量限分別為0.5 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1和2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1，如表2所示。

2.5.2 回收率和精密度

稱取空白基質(zhì)5.00 g，添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.2.1），使金剛烷胺質(zhì)量濃度為0.5 μg·kg-1、 1.0 μg·kg-1和2.5 μg·kg-1、金 剛 乙 胺 質(zhì) 量 濃 度 為 2.0 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1，按1.2.4步 驟進(jìn)行操作，對(duì)低、中、高3個(gè)濃度平行測(cè)定6次。如表3所示，平均回收率為93.43%～98.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.92%～4.14%。結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確度和較高的精密度。

表3 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用改進(jìn)的QuEChERS技術(shù)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了雞蛋中金剛烷胺和金剛乙胺殘留量的檢測(cè)方法。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。該方法前處理過程簡便、線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度和精密度高，可為雞蛋中金剛烷胺和金剛乙胺殘留量的檢測(cè)提供參考依據(jù)。