高效液相色譜法同步測定水產品中 3種四環素類抗生素殘留量

◎ 趙宇英

（廈門市食品藥品質量檢驗研究院，福建 廈門 361012）

土霉素、四環素、金霉素同屬天然四環素類（Tetracyclines，TCs）藥物，長期使用有較大的毒副作用，因此檢測食品中的土霉素、四環素、金霉素的殘留量就顯得尤為重要。目前的檢測方法主要包括微生物法[1]、高效液相色譜法[2-3]、液相色譜-質譜法[4]、酶聯免疫法[5]等。其中，高效液相色譜法和液質聯用法是現階段實驗過程中的首選方法。和質譜檢測器相比，由于TCs有很好的紫外吸收特性，在酸性溶液中的紫外最大吸收波長一般在350～380 nm，干擾較少；此外，紫外檢測器不僅能夠滿足殘留檢測的要求，且分析成本更低[6]。因此，本文研究在現有的液相色譜法基礎上，以魚、蝦樣品為研究對象，優化針對水產品樣品中四環素類抗生素的定量、定性分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素（純度96.5%）、四環素（純度96.2%）、金霉素標準品（純度92.5%）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）；實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

Waters2695高效液相色譜儀+紫外檢測器，美國Waters公司；MV5全自動氮吹濃縮儀，北京萊伯泰科LabTech儀器有限公司；預處理柱（Oasis HLB柱）、色譜柱（XBridge BEH C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液的配制：用甲醇溶解配制濃度為100 mg·L-1的土霉素、四環素標準儲備液，濃度為200 mg·L-1的金霉素標準儲備液。

標準曲線的配制：用乙腈+0.1%甲酸水溶液（2+8）配制成土霉素、四環素含量為0.05 μg·mL-1、 0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1和1.00 μg·mL-1， 金霉素含量為0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1和2.00 μg·mL-1的混合標準溶液。

1.3.2 色譜條件

柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：5 μL；流動相：乙腈（A）和0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫；檢測波長：355 nm。

1.3.3 樣品前處理

（1）樣品的制備。該實驗樣品分別為Sam-1（蝦，去頭去殼，取可食用肌肉部分）、Sam-2（生魚肉，去鱗去皮沿背脊取肌肉），充分搗碎均質。

（2）樣品的提取。稱取5.0 g制備后的樣品于50 mL聚乙烯離心管中，依次加入20 mL、20 mL、10 mL的0.1 mol·L-1Na2EDTA-Mclvaine緩 沖 溶 液 冰 水 浴超 聲提取3次，每次10 min，并渦旋振蕩提取3 min后在 4 ℃，13 000 r·min-1條件下離心3 min，合并上清液定容至50 mL，再次離心后經濾紙過濾，準確吸取上述提取液5.0 mL待固相萃取柱（Oasis HLB）凈化。

（3）樣品的凈化。依次以5 mL甲醇和5 mL實驗用水活化Oasis HLB柱后，將上述5.0 mL提取液上樣，再用5 mL蒸餾水、5mL 5%甲醇水溶液進行淋洗，抽干后，用5 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液在40 ℃氮吹濃縮至干，用1.0 mL流動相溶液復溶，渦旋混勻上機測定。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

本研究采用了XBridge BEH C18液相色譜柱，提取溶劑為Na2EDTA-Mclvaine緩沖溶液，設計了3組流動性體系：乙腈∶0.1%甲酸水溶液（20∶80，梯度洗脫）、乙腈∶0.048%的磷酸溶液（20∶80，梯度洗脫）、乙腈∶0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（20∶80，等度洗脫）。各體系的色譜圖詳見圖1～圖3（TMS、SHS、JMS分別代表土霉素、四環素和金霉素）。

由圖1～圖3可知，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相的色譜峰型尖峭，無雜峰，且具有良好的線性關系，相關系數均達到0.999以上；以乙腈和0.048%的磷酸溶液為流動相，對稱性不佳，有雜峰，分離效果不好，出現干擾，相關系數達到0.995；以乙腈和 0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液為流動相等度洗脫，只有3個濃度較高的有響應，方法的靈敏度達不到要求。

圖1 乙腈和0.1%甲酸水溶液梯度洗脫色譜圖

圖3 乙腈和0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液等度洗脫色譜圖

圖2 乙腈和0.048%的磷酸溶液梯度洗脫色譜圖

2.2 前處理條件的優化

本次研究選擇乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相體系，結果顯示Na2EDTA-Mclvaine緩沖溶液的提取效果最好，其中蝦樣品回收率為85.2%～91.5%，魚樣品回收率為87.0%～94.0%；甲醇溶液作為提取試劑，蝦樣品回收率在25.2%～32.0%，魚樣品回收率在23.5%～43.0%；磷酸鹽緩沖溶液作為提取試劑，蝦樣品回收率在23.2%～33.0%，魚樣品回收率在29.2%～35.5%。

2.3 方法學評價

2.3.1 線性范圍、檢出限

本研究采用基底外標法對目標化合物進行定量分析。結果顯示3種四環素類抗生素在一定的濃度范圍內線性關系良好，具體情況詳見表1。

表1 3種四環素類抗生素的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限表

2.3.2 回收率和精密度

在最優前處理方法以及液相色譜條件下檢測，各化合物加標回收和相對標準偏差測定結果如表2所示。3種四環素類抗生素在蝦、魚陰性樣品的高、中、低3個加標水平濃度下的加標回收率為85.5%～105.0%，RSD為1.2%～3.1%。

3 結論

本研究選擇魚和蝦作為樣本，通過實驗優化了水產品中土霉素、四環素、金霉素殘留的高效液相色譜-紫外檢測器分析方法。該方法操作簡便、靈敏度高、回收率好，能夠滿足水產品中土霉素、四環素、金霉素殘留量檢測的要求，并且更加經濟環保。