抗氧化反應元件信號通路調控膽囊癌細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的機制研究

郭貽龍，陳寶，黎偉

作者單位：海口市人民醫院，a急診科，b藥學部，海南 海口 570208

膽囊癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，由于膽囊癌病人早期臨床癥狀不明顯導致病人確診時已處于中晚期從而失去最佳治療時機［1-3］。血根堿主要分布于博落回與白屈菜的全草及血水草的地上部分，既往研究顯示血根堿具有抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性［4-5］。但血根堿對膽囊癌的作用及其機制尚未可知。Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）/核因子E2相關因子2（Nrf2）/抗氧化反應元件（ARE）信號通路屬于抗氧化應激通路，研究表明抑制Ke?ap1/Nrf2/ARE信號通路激活可促進腫瘤細胞凋亡［6］。但血根堿是否通過調控Keap1/Nrf2/ARE信號通路影響膽囊癌細胞生物學行為尚未闡明。本研究于2018年1月至2019年9月觀察了血根堿對膽囊癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，并進一步分析了其對Keap1/Nrf2/ARE信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料人膽囊癌細胞GBC-SD購自美國ATCC細胞庫；胎牛血清、DMEM培養基購自美國Thermo Fisher公司；血根堿購自南京道斯夫生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）購自美國Sigma公司；丙二醛、活性氧、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Matrigel基質膠、Transwell小室購自美國Corning公司；膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗人增殖細胞核抗原（PCNA）、增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67（Ki-67）、活化胱天蛋白 酶-3（cleaved-caspase-3）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）一抗購自美國Santa Cruz公司；兔抗人Keap1、Nrf2、血紅素加氧酶1（HO-1）一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 取人膽囊癌細胞GBC-SD，接種至含10%胎牛血清體積分數和1%雙抗體積分數的DMEM培養基內，置于37℃、5%二氧化碳體積分數的細胞培養箱內常規培養，待細胞生長至密度達90%時加入0.25%胰蛋白酶消化后進行傳代培養。取對數期GBC-SD細胞，分別接種至含有2、4、8 μmol/L血根堿的培養基中常規培養48 h［7］，記為血根堿低濃度組、血根堿中濃度組、血根堿高濃度組，另取未進行任何處理的人膽囊癌細胞GBC-SD記為空白組。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖抑制率 收集各組長至對數期的人膽囊癌細胞GBC-SD，調整為3×104個/mL的細胞懸液，按100μL/孔接種于96孔板，每組3個復孔。加入20μL/孔的MTT溶液培養4 h，棄去上清，以DMSO（150μL/孔）孵育10 min，上多功能酶標儀測定各組人膽囊癌細胞GBC-SD吸光度值（OD 490 nm）。細胞增殖抑制率（%）=［（1-OD實驗組/OD空白對照組）×100%］。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組長至對數期的人膽囊癌細胞GBC-SD，調整細胞濃度為1×104個/mL，加入預冷過的PBS洗滌，4℃條件下以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加500μL結合緩沖液重懸細胞，之后加入Annexin V-FITC和PI各5μL，充分混勻于暗室反應20 min，上流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 收集各組長至對數期的人膽囊癌細胞GBC-SD，消化后加入無血清培養基并調整細胞密度為5×104個/mL，將細胞懸液以200μL/孔接種至Transwell小室的上室，另按照600μL/孔將含10%胎牛血清的培養基加入至Transwell小室的下室，置于37℃、5%二氧化碳體積分數的培養箱內孵育24 h，加多聚甲醛固定20 min后加入0.1%結晶紫染色10 min，于光學顯微鏡下觀察并計數遷移細胞。侵襲實驗中的Transwell小室上室需要預先鋪設Matrigel基質膠，其余操作同遷移實驗，光學顯微鏡下觀察并計數侵襲細胞。

1.2.5 檢測活性氧、丙二醛、GSH含量與SOD活性

應用熒光探針DCFH-DA檢測細胞內活性氧水平：不含血清培養基稀釋DCFH-DA（20μmol/L），37℃恒溫培養箱孵育30 min，利用多功能酶標儀與機關共聚焦顯微鏡檢測細胞內活性氧水平，以空白組為對照計算實驗組活性氧含量。收集各組對數期GBC-SD細胞，采用WST-1法檢測SOD活力；采用微量酶標法檢測GSH含量；采用硫代巴比妥酸法檢測丙二醛含量，以上各實驗均根據試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、cleaved-caspase-3、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達 收集各組長至對數期的人膽囊癌細胞GBCSD，加裂解液裂解30 min，通過蛋白提取試劑盒提取蛋白。BCA法蛋白定量。將蛋白樣品加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）上樣緩沖液，高溫煮沸10 min制成蛋白樣液。以30μg/孔蛋白樣液上樣至凝膠，經電泳分離，轉膜，封閉，加入PC?NA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、cleaved-caspase-3、Ke?ap1、Nrf2、HO-1與β肌動蛋白（β-actin）一抗，4℃孵育24 h，次日加入相應二抗，37℃條件下孵育2 h，經TBST充分漂洗后曝光顯影，應用ImageJ 1.41軟件分析各條帶灰度值，上述所有操作均重復實驗3次。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布以±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行兩組間比較，采用單因素方差分析進行多組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的血根堿對膽囊癌細胞增殖的抑制作用用不同濃度的血根堿處理GBC-SD細胞，結果顯示，與空白組相比，血根堿低濃度組、血根堿中濃度組、血根堿高濃度組GBC-SD細胞抑制率顯著升高（P<0.05），PCNA、Ki-67蛋白相對表達量顯著降低（P<0.05），見圖1，表1。

圖1 蛋白質印跡法檢測膽囊癌細胞PCNA和Ki-67蛋白表達

表1 血根堿抑制膽囊癌細胞存活及PCNA和Ki-67蛋白表達/±s

表1 血根堿抑制膽囊癌細胞存活及PCNA和Ki-67蛋白表達/±s

注：PCNA為增殖細胞核抗原，Ki-67為細胞增殖核抗原-67。①與空白組比較，P<0.05。

組別空白組血根堿低濃度組血根堿中濃度組血根堿高濃度組F值P值重復次數3333 PCNA蛋白1.18±0.09 0.83±0.07①0.67±0.07①0.45±0.05①166.75<0.001 Ki-67蛋白1.04±0.09 0.87±0.07①0.73±0.08①0.63±0.05①52.10<0.001細胞抑制率/%2.07±0.68 12.49±1.53①23.08±2.64①44.67±3.68①511.93<0.001

2.2 血根堿抑制膽囊癌細胞遷移和侵襲與空白組相比，血根堿低濃度組、血根堿中濃度組、血根堿高濃度組遷移、侵襲細胞數及MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量均顯著降低（P<0.05），見表2，圖2。

圖2 蛋白質印跡法檢測膽囊癌細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達

表2 血根堿抑制膽囊癌細胞遷移和侵襲及MMP-2和MMP-9蛋白表達/±s

表2 血根堿抑制膽囊癌細胞遷移和侵襲及MMP-2和MMP-9蛋白表達/±s

注：MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。①與空白組比較，P<0.05。

組別空白組血根堿低濃度組血根堿中濃度組血根堿高濃度組F值P值重復次數3 3 3 3 MMP-2 0.85±0.06 0.46±0.05①0.38±0.04①0.25±0.03①279.21<0.001 MMP-9 0.72±0.08 0.37±0.05①0.21±0.04①0.17±0.03①197.97<0.001細胞遷移數/個243.19±15.48 146.34±12.56①98.85±9.82①75.79±7.37①361.23<0.001細胞侵襲數/個136.68±8.37 97.43±7.15①46.65±5.34①38.15±4.53①449.77<0.001

2.3 血根堿誘導膽囊癌細胞凋亡與空白組相比，血根堿低濃度組、血根堿中濃度組、血根堿高濃度組細胞凋亡率及cleaved-caspase-3蛋白相對表達量顯著升高（P<0.05），見圖3，表3。

表3 血根堿誘導膽囊癌細胞凋亡和增加cleaved-caspase-3蛋白表達/±s

表3 血根堿誘導膽囊癌細胞凋亡和增加cleaved-caspase-3蛋白表達/±s

注：cleaved-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與空白組比較，P<0.05。

組別空白組血根堿低濃度組血根堿中濃度組血根堿高濃度組F值P值重復次數3 3 3 3 cleaved-caspase-3 0.15±0.02 0.29±0.03①0.35±0.04①0.41±0.05①82.67<0.001細胞凋亡率/%3.62±0.63 8.59±1.02①14.16±1.14①18.84±1.65①288.73<0.001

圖3 流式細胞術檢測各組膽囊癌細胞凋亡情況

2.4 血根堿對膽囊癌細胞氧化應激的影響實驗結果顯示，與空白組相比，血根堿低濃度組、血根堿中濃度組、血根堿高濃度組細胞活性氧、丙二醛水平顯著升高（P<0.05），SOD活性與GSH含量顯著降低（P<0.05），見表4。

表4 血根堿對膽囊癌細胞活性氧含量、SOD活性、GSH含量和丙二醛含量的影響/±s

表4 血根堿對膽囊癌細胞活性氧含量、SOD活性、GSH含量和丙二醛含量的影響/±s

注：SOD為超氧化物歧化酶，GSH為還原型谷胱甘肽。①與空白組比較，P<0.05。

組別空白組血根堿低濃度組血根堿中濃度組血根堿高濃度組F值P值重復次數3333活性氧（相對于空白組）1.04±0.08 1.34±0.06①1.85±0.09①2.23±0.13①287.90<0.001 SOD/（kU/g prot）76.17±4.64 61.84±5.7*①53.73±4.83①47.14±4.25①58.59<0.001 GSH/（μmol/g prot）34.66±2.14 21.94±2.86①17.38±2.05①12.55±1.83①161.11<0.001丙二醛/（μmol/g prot）4.59±0.71 13.48±1.17①23.79±1.73①34.16±2.25①593.31<0.001

2.5 血根堿誘導膽囊癌細胞Keap1/Nrf2/ARE信號通路的影響與空白組相比，血根堿低濃度組、血根堿中濃度組、血根堿高濃度組細胞中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量顯著降低（P<0.05），見表5。

表5 血根堿對膽囊癌細胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達的影響/ˉ±s

表5 血根堿對膽囊癌細胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達的影響/ˉ±s

注：Keap1為Kelch樣ECH相關蛋白1，Nrf2為核因子E2相關因子2，HO-1為血紅素加氧酶1。①與空白組比較，P<0.05。

組別空白組血根堿低濃度組血根堿中濃度組血根堿高濃度組F值P值重復次數3333 Keap1 0.89±0.08 0.67±0.09①0.56±0.06①0.34±0.05①91.63<0.001 Nrf2 0.68±0.05 0.49±0.06①0.38±0.06①0.35±0.04①71.04<0.001 HO-1 0.63±0.07 0.58±0.06①0.54±0.05①0.28±0.04①56.17<0.001

3 討論

膽囊癌發展過程中涉及多種基因和信號通路的異常，相關研究表明有多種藥物可通過調控膽囊癌細胞的增殖、凋亡等生物學行為進而實現治療作用［8-9］。然而，中醫藥有效成分在治療膽囊癌中的作用機制尚未闡明，因而本研究積極探究藥物對膽囊癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響。血根堿可通過促進氧化應激反應的發生而誘導卵巢癌細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長［10］。研究表明血根堿在胰腺癌等多種腫瘤發生過程中發揮抗癌作用，并可抑制腫瘤發展進程［11］。與上述研究結果相似，本研究結果顯示血根堿可明顯抑制膽囊癌細胞增殖，并可抑制PCNA、Ki-67蛋白表達。研究表明PCNA、Ki-67屬于細胞增殖標記物，其在腫瘤中呈高表達并可促進細胞增殖［12］。本研究結果提示血根堿可能通過抑制PCNA、Ki-67表達從而抑制膽囊癌細胞增殖。MMP-2、MMP-9是腫瘤轉移相關基因并可促進腫瘤細胞遷移及侵襲［13］。本研究結果顯示血根堿可顯著抑制膽囊癌細胞的遷移和侵襲，并抑制MMP-2、MMP-9蛋白表達，這提示血根堿可能是通過下調MMP-2、MMP-9的表達實現減弱膽囊癌細胞遷移及侵襲能力的作用。caspase-3處于caspase級聯反應的下游，并可作為凋亡執行者，當細胞接收凋亡信號時激活caspase-3促進cleaved-caspase-3的生成進而誘導細胞凋亡［14］。本研究結果顯示血根堿處理膽囊癌細胞后，細胞凋亡率及cleaved-caspase-3表達量均明顯顯著升高，提示血根堿可能是通過上調cleaved-caspase-3的表達誘導膽囊癌細胞凋亡。

細胞氧化應激與細胞凋亡密切相關，本研究進一步檢測氧化應激相關指標，結果顯示血根堿處理后，膽囊癌細胞中活性氧、丙二醛水平明顯升高，SOD活性與GSH含量明顯降低，與相關文獻報道結果相似［15］。說明血根堿可能通過消耗膽囊癌細胞中的SOD與GSH而降低其抗氧化能力，促進細胞發生氧化應激反應，同時產生大量活性氧進而促進丙二醛含量增加最終抑制細胞增殖。提示血根堿對膽囊癌細胞的殺傷能力與細胞內氧化應激反應存在相關性。Keap1/Nrf2/ARE信號通路是重要的抗氧化通路，信號通路關鍵蛋白主要為Keap1、Nrf2、HO-1，Keap1與Nrf2分離后，活化的Nrf2進入細胞核后可與ARE結合從而促進抗氧化蛋白HO-1表達［16］。研究表明多種中藥有效成分可通過調控Ke?ap1/Nrf2/ARE信號通路從而發揮抗癌作用［17-19］。本研究結果顯示血根堿處理后膽囊癌細胞中Keap1、核-Nrf2、質-HO-1蛋白表達明顯降低，說明血根堿促進膽囊癌細胞凋亡可能與Keap1/Nrf2/ARE信號通路有關。提示血根堿可能通過調控Keap1/Nrf2/ARE信號通路從而發揮抗膽囊癌作用。

綜上所述，血根堿能夠抑制膽囊癌細胞增殖、遷移及侵襲，誘導細胞凋亡，調節細胞內氧化應激反應，其作用機制可能與調控Keap1/Nrf2/ARE信號通路有關，這對血根堿在腫瘤防治方面的研究具有一定指導意義，可為膽囊癌治療藥物的研發提供新方向。本研究僅初步探討血根堿對膽囊癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用及其可能的分子機制，關于其具體作用機制仍需深入研究。