粗糠柴毒素上調微小RNA-204-5p對脂多糖所致心肌損傷的保護機制研究

于兆海，于悅

作者單位：1青島市黃島區人民醫院藥劑科，山東 青島 266400；2山東第一醫科大學公共管理學院公共事業管理專業，山東 泰安 271000

心肌損傷是導致多種心血管疾病的重要原因，也是膿毒癥［1］和糖尿病［2］常見的并發癥。因此，保護心肌細胞免受損傷對相關疾病的防治具有重要意義。革蘭陰性菌細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）是引起細胞感染的主要成分，LPS可以增加心肌細胞NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）的表達及過氧化物的增殖，造成活性氧的增加，進而造成心肌細胞損傷或者直接導致心肌細胞凋亡［3］。粗糠柴毒素（Rottlerin）是從傳統藥物粗糠柴中提取的小分子物質［4］，研究報道其有促凋亡和抑制凋亡的雙重作用［5］。Rottlerin可抑制活性氧產生，清除氧自由基［6］。研究表明，Rottlerin可通過抑制蛋白激酶Cδ（PKC-δ）的活性減少腎小管上皮細胞凋亡［7］。Rot?tlerin可抑制碘帕醇誘導的NRK-52E細胞凋亡［8］。miRNAs是一類長度約22個核苷酸的內源性非編碼小RNA，多種miRNAs在心肌缺血缺氧時顯著差異表達，對心血管疾病的發生和發展起著重要作用，參與心肌損傷等病理生理過程［9］。選擇性上調或下調特定miRNA表達可作為未來治療心肌I/RI的新工具和診斷心血管疾病的敏感生物標志物［10］。自2018年9月至2019年4月研究了粗糠柴毒素對LPS所致心肌損傷的影響及其可能的作用機制，為尿毒癥、心功能衰竭等疾病的臨床治療提供新的靶向藥物和研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料HCM、AC16心肌細胞購于中國科學院上海細胞庫；粗糠柴毒素購于Abcam公司；Lipo?fectamineTM2S購于Sigma公司；RPMI-1640培養基購于美國Gibico公司；熒光定量試劑盒、反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、Trizol均購于Solarbio（北京）公司；RIPA蛋白裂解液、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）和碘化丙啶（PI）試劑盒均購于碧云天（上海）生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下，HCM、AC16細胞用RPMI-1640培養基培養，待細胞融合至60%~70%左右時，使用胰蛋白酶消化并傳代。收集對數生長期的HCM、AC16細胞進行下一步實驗。

1.2.2 藥物處理與分組 參考李曉寧等［8］和劉丹等［11］所用的粗糠柴毒素和LPS濃度；用終濃度為10 mg/L的LPS刺激心肌細胞6 h，分別加入終濃度為0.5μmol/L、1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L粗糠柴毒素再處理12 h后分別記為LPS+0.5μmol/L Rot?tlerin組、LPS+1.0μmol/L Rottlerin組、LPS+1.5μmol/L Rottlerin組、LPS+2.0μmol/L Rottlerin組，以單純10 mg/L LPS處理的為LPS組，以未經粗糠柴毒素和LPS處理的為對照組。采用LipofectamineTM2 000轉染試劑盒在未經處理的HCM細胞中依次轉染模擬物陰性對照（miR-NC），miR-204-5p模擬物（miR-204-5p）、抑制劑陰性對照（anti-miR-NC）、miR-204-5p抑制劑（anti-miR-204-5p），標記為miR-NC組，miR-204-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-204-5p組。在10 mg/L LPS處理的HCM細胞中轉染miR-NC，miR-204-5p，標記為LPS+miR-NC組，LPS+miR-204-5p組。將anti-miR-NC、anti-miR-204-5p、過表達空載體（pcDNA3.1）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）過表達載體（pcDNA3.1-HMGB1）轉染至2.0μmol/L粗糠柴毒素和10 mg/L LPS處理HCM細胞中，記為LPS+Rottlerin+anti-miR-NC組、LPS+Rottlerin+antimiR-204-5p組、LPS+Rottlerin+pcDNA3.1組、LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1組。

1.2.3 MTT法檢測HCM、AC16細胞增殖 各組HCM、AC16細胞分別培養24 h、48 h、72 h時，加入5 g/L MTT溶液20μL，4 h后，棄去多余培養基，添加二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩10 min，然后用酶標儀在490 nm處檢測光密度（OD）值。抑制率（%）=（1-OD實驗組/OD空白對照組）×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測HCM、AC16細胞凋亡 離心收集各組經胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化的HCM、AC16細胞，PBS漂洗5 min×2，接著加入結合緩沖液重懸HCM、AC16細胞。依據Annexin V-FITC和PI試劑盒說明書對HCM、AC16細胞進行避光孵育。最后使用流式細胞儀檢測488 nm（激發波長）和530 nm（發射波長）處的熒光強度。

1.2.5 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）測定miR-204-5p和HMGB1 mRNA水平 用Trizol試劑提取HCM、AC16細胞總RNA，測得RNA純度和濃度后，采用反轉錄試劑盒將其逆轉錄成互補DNA（cDNA）。按照熒光定量試劑盒的制造商說明制備PCR反應體系。在PCR儀上進行擴增。循環條件（40個）為95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，60℃延長5 min。以β肌動蛋白（β-actin）為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測HMGB1及凋亡相關蛋白表達RIPA裂解液裂解各組HCM、AC16細胞，在4℃離心機中離心15 min（12 000g），收集蛋白上清液，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，轉移至聚偏二氟乙烯膜下用5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入HMGB1、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入相應的1∶2 000稀釋的二抗，室溫下反應2 h，后遮光顯影、定影后，用Quantity One凝膠分析軟件分析膠片，以目的條帶和β-actin條帶的光密度比值作為蛋白表達水平。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗證實miR-204-5p與HMGB1的靶向關系TargetScan數據庫顯示HMGB1 3′非翻譯區（3′UTR）和miR-204-5p有互補的核苷酸序列。構建HMGB1 3′UTR野生型和突變型基因靶點的熒光素酶表達載體（WT-HMGB1和MUT-HMGB1），將HCM細胞以5×104個/孔的濃度接種至24孔板，用LipofectamineTM2 000將miR-NC和miR-204-5p分別轉染至WT-HMGB1和MUTHMGB1組細胞。使用熒光素酶報告基因檢測儀進行酶活測定。以熒光素酶和Renilla活性的比值作為最終的實驗結果。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.00軟件進行統計分析。計量資料以xˉ±s表示，兩組比較行成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Rottlerin對miR-204-5p、HMGB1的表達及對LPS作用的心肌細胞HCM、AC16增殖凋亡的影響 相較于對照組，LPS組心肌細胞HCM、AC16的抑制率顯著升高，miR-204-5p的表達水平顯著降低，Bcl-2表達顯著下降，Bax、HMGB1表達顯著增高，凋亡率顯著升高（P<0.05）；相較于LPS組，不同濃度Rottlerin處理心肌細胞HCM、AC16細胞后，抑制率顯著降低，miR-204-5p的表達水平顯著增高，Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，Bax、HMGB1蛋白的表達水平顯著降低，凋亡率顯著降低（P<0.05），呈濃度依賴型。見表1，2；圖1。選用對Rottlerin較為敏感的HCM細胞做后續實驗。

圖1 粗糠柴毒素（Rottlerin）對各組心肌細胞HCM中HMGB1和凋亡相關蛋白表達的影響

表1 Rottlerin對LPS作用的各組心肌細胞HCM、AC16增殖的影響/（%，xˉ±s）

2.2 過表達miR-204-5p對LPS處理的HCM心肌細胞增殖、凋亡的影響LPS+miR-NC組與對照組相比，HCM細胞中miR-204-5p和Bcl-2表達下降，Bax表達升高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率升高（P<0.05）；LPS+miR-204-5p組與LPS+miR-NC組相比，HCM細胞中miR-204-5p表達升高，Bcl-2表達升高，Bax表達降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率降低（P<0.05）。見表3，圖2。

表3 過表達miR-204-5p對LPS作用的各組細胞HCM增殖、凋亡的影響/±s

表3 過表達miR-204-5p對LPS作用的各組細胞HCM增殖、凋亡的影響/±s

注：miR-204-5p為微小RNA-204-5p，LPS為脂多糖，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。①與對照組比較，P<0.05。②與LPS+miR-NC組比較，P<0.05。

組別對照LPS+miR-NC LPS+miR-204-5p F值P值重復次數666 miR-204-5p 1.00±0.07 0.42±0.03①0.86±0.07②154.09<0.001 Bcl-2蛋白0.87±0.03 0.22±0.02①0.71±0.05②543.32<0.001 Bax蛋白0.31±0.01 0.96±0.06①0.43±0.02②525.22<0.001抑制率/%24 h 1.02±0.02 74.06±5.07①52.21±4.08②597.33<0.001 48 h 2.41±0.02 80.75±6.06①59.98±5.13②470.31<0.001 72 h 4.52±0.06 88.48±8.04①64.57±5.67②347.97<0.001凋亡率/%6.34±0.11 27.26±2.25①15.76±1.32②289.85<0.001

圖2 過表達微小RNA-204-5p對脂多糖（LPS）作用的各組心肌細胞HCM增殖、凋亡的影響

2.3 抑制miR-204-5p表達能逆轉Rottlerin對LPS作用的心肌細胞HCM增殖、凋亡的作用qRTPCR檢測結果顯示，與LPS組相比，LPS+Rottlerin組心肌細胞HCM中miR-204-5p和Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，Bax蛋白的表達水平顯著降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率顯著降低（P<0.05）；與LPS+Rottlerin+anti-miR-NC組相比，LPS+Rottlerin+anti-miR-204-5p組 心 肌 細 胞HCM中miR-204-5p和Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，Bax蛋白的表達水平顯著增高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率顯著升高（P<0.05）。見表4，圖3。

表4 抑制miR-204-5p表達能逆轉Rottlerin對各組心肌細胞增殖、凋亡的作用/±s

表4 抑制miR-204-5p表達能逆轉Rottlerin對各組心肌細胞增殖、凋亡的作用/±s

注：miR-204-5p為微小RNA-204-5p，Rottlerin為粗糠柴毒素，LPS為脂多糖，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。①與LPS組比較，P<0.05。②與LPS+Rottlerin+anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別LPS LPS+Rottlerin LPS+Rottlerin+anti-miR-NC LPS+Rottlerin+anti-miR-204-5p F值P值重復次數66 6 6 miR-204-5p 0.43±0.03 0.73±0.06①0.71±0.05 0.59±0.05②48.08<0.001 Bcl-2蛋白0.25±0.02 0.69±0.05①0.72±0.06 0.53±0.01②168.33<0.001 Bax蛋白0.99±0.06 0.24±0.02①0.26±0.02 0.77±0.06②421.30<0.001抑制率/%24 h 74.06±5.07 54.21±4.08①55.33±4.25 66.07±5.19②24.41<0.001 48 h 81.35±6.06 59.98±5.13①60.24±5.37 71.19±6.04②19.50<0.001 72 h 89.94±8.14 64.57±5.67①66.81±4.02 78.67±6.12②21.71<0.001凋亡率/%26.26±2.13 11.06±1.09①12.16±1.12 18.37±1.54②125.19<0.001

圖3 抑制微小RNA-204-5p表達能逆轉粗糠柴毒素（Rottlerin）對各組心肌細胞增殖、凋亡的作用

表2 Rottlerin對LPS作用的各組心肌細胞HCM凋亡及miR-204-5p、HMGB1表達的影響/±s

表2 Rottlerin對LPS作用的各組心肌細胞HCM凋亡及miR-204-5p、HMGB1表達的影響/±s

注：Rottlerin為粗糠柴毒素，LPS為脂多糖，miR-204-5p為微小RNA-204-5p，HMGB1為高遷移率族蛋白B1，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。①與對照組比較，P<0.05。②與LPS組比較，P<0.05。③與LPS+Rottlerin 0.5μmol/L組比較，P<0.05。④與LPS+Rottlerin 1.0μmol/L組比較，P<0.05。⑤與LPS+Rottlerin 1.5μmol/L組比較，P<0.05。

組別對照LPS LPS+Rottlerin 0.5μmol/L LPS+Rottlerin 1.0μmol/L LPS+Rottlerin 1.5μmol/L LPS+Rottlerin 2.0μmol/L F值P值重復次數6 6 6 6 6 6 miR-204-5p 1.99±0.08 0.30±0.03①0.46±0.04①②0.54±0.05①②③0.76±0.04①②③④0.88±0.07①②③④⑤745.94<0.001 HMGB1蛋白0.26±0.02 1.04±0.10①0.93±0.09①②0.80±0.08①②③0.62±0.06①②③④0.53±0.05①②③④⑤94.61<0.001 Bcl-2蛋白0.94±0.08 0.16±0.03①0.31±0.03①②0.56±0.04①②③0.69±0.04①②③④0.86±0.04①②③④⑤260.05<0.001 Bax蛋白0.33±0.02 1.06±0.08①0.97±0.06①②0.89±0.07①②③0.66±0.04①②③④0.54±0.05①②③④⑤145.59<0.001凋亡率/%5.61±0.05 27.79±2.23①22.61±2.14①②20.06±1.94①②③11.71±1.01①②③④9.16±1.00①②③④⑤174.70<0.001

2.4 miR-204-5p靶向HMGB1TargetScan預測結果顯示HMGB1和miR-204-5p存在相互結合的核苷酸位點。轉染WT-HMGB1后，miR-204-5p組熒光素酶活性（0.33±0.02）明顯低于miR-NC組（1.01±0.05）（t=30.93，P<0.001）；而轉染MUT-HMGB1后，miR-204-5p組熒光素酶活性（1.08±0.05）與miR-NC組（1.06±0.04）比較，差異無統計學意義（t=0.77，P=0.462）。miR-204-5p組HMGB1 mRNA和蛋白表達明顯比miR-NC組低（P<0.05），anti-miR-204-5p組HMGB1 mRNA和蛋白表達明顯比anti-miR-NC組高（P<0.05），見表5。

表5 miR-204-5p對HMGB1表達的影響/±s

表5 miR-204-5p對HMGB1表達的影響/±s

注：miR-204-5p為微小RNA-204-5p，HMGB1為高遷移率族蛋白B1。①與miR-NC組比較，P<0.05。②與anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別miR-NC miR-204-5p anti-miR-NC anti-miR-204-5p F值P值重復次數6666 HMGB1 mRNA 0.38±0.02 0.10±0.01①0.43±0.05 1.22±0.11②367.40<0.001 HMGB1蛋白0.41±0.03 0.09±0.01①0.44±0.03 1.18±0.11②364.91<0.001

2.5 過表達HMGB1能逆轉Rottlerin對LPS作用的心肌細胞HCM增殖、凋亡的作用與LPS組相比，LPS+Rottlerin組心肌細胞HCM中Bcl-2表達升高，Bax、HMGB1表達降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率降低（P<0.05）；與LPS+Rottlerin+pcDNA3.1組相比，LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1組心肌細胞HCM中Bcl-2表達降低，Bax、HMGB1表達升高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率升高（P<0.05）。見表6。

表6 過表達HMGB1能逆轉Rottlerin對心肌細胞HCM增殖、凋亡的作用/±s

表6 過表達HMGB1能逆轉Rottlerin對心肌細胞HCM增殖、凋亡的作用/±s

注：HMGB1為高遷移率族蛋白B1，Rottlerin為粗糠柴毒素，LPS為脂多糖，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。①與LPS組比較，P<0.05。②LPS+Rottlerin+pcDNA3.1組比較，P<0.05。

組別LPS LPS+Rottlerin LPS+Rottlerin+pcDNA3.1 LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1 F值P值重復次數6666 HMGB1蛋白1.45±0.11 0.76±0.07①0.77±0.07 1.08±0.09②84.93<0.001 Bcl-2蛋白0.24±0.02 0.57±0.04①0.59±0.05 0.41±0.04②104.49<0.001 Bax蛋白0.89±0.06 0.24±0.02①0.22±0.02 0.64±0.04②423.57<0.001抑制率/%24 h 75.06±5.07 54.21±4.08①53.33±4.06 68.77±6.02②29.40<0.001 48 h 80.95±6.16 59.98±5.13①57.24±4.87 72.19±6.74②21.87<0.001 72 h 91.14±8.36 64.57±5.67①62.81±4.62 81.67±7.12②25.84<0.001凋亡率/%27.26±2.33 12.06±1.09①11.46±1.12 15.37±1.24②137.88<0.001

3 討論

LPS進入血液中會引起急性全身免疫系統反應，其中急性心肌炎癥會使心臟收縮力下降、心率加快、射血分數減少，導致心功能不全；嚴重時會導致心功能衰竭甚至死亡，對人類生命健康危害極大［12］。研究表明中藥具有減少炎性細胞浸潤、抑制心肌細胞凋亡、清除自由基、減輕鈣超載、抗脂質過氧化等作用［13］。粗糠柴毒素是中藥粗糠柴的重要成分，Rottlerin可顯著提升缺血-再灌注心肌的AL?DH2磷酸化水平，減輕I/R引起的心肌細胞死亡，起到心臟保護的作用［14］。Rottlerin可通過抑制PKCδ-ERK1/2通路減輕6-羥基多巴胺所致多巴胺能細胞凋亡［15］。Rottlerin通過改善心肌細胞收縮和冠狀動脈灌注，顯著改善心臟停搏后的心臟功能［16］。Rot?tlerin可顯著減輕細胞缺氧損傷形態改變，增強缺氧損傷后的細胞活力［17］。本實驗結果顯示，Rottlerin可保護LPS所致的心肌細胞損傷，且呈濃度依賴性。

研究表明，miRNA可通過控制心肌的細胞凋亡，降低心血管疾病的發生［18］，其還可調節血管損傷、血管重塑過程［19］。研究發現，抑制miR-204-5p的表達能通過調控Sirt1促進糖尿病角膜上皮的損傷修復［20］。miR-204-5p過表達能抑制結直腸癌細胞的上皮細胞-間充質轉化進程，并降低細胞增殖、侵襲、遷移能力［21］。miR-204-5p通過調節SIX1表達抑制肝細胞癌增殖［22］。miR-204-5p可以通過靶基因CCND1抑制肺癌細胞的增殖能力［23］。miR-204-5p通過抑制IGFBP5抑制乳頭狀甲狀腺癌中細胞增殖［24］。miR-204-5p通過抑制CXCR4的表達來調節口腔鱗狀細胞癌中細胞的增殖和轉移［25］。miR-204-5p通過下調USP47和RAB22A抑制胃癌細胞增殖［26］。衰老心肌細胞缺氧處理后miR-204下調表達，且缺氧后處理對缺氧復氧所致的衰老心肌細胞損傷的保護作用減弱與miR-204有很大關系［27］。本研究結果顯示，過表達miR-204-5p可保護LPS所致的心肌細胞損傷。且Rottlerin可上調miR-204-5p的表達，抑制miR-204-5p表達能逆轉Rottlerin對LPS作用的心肌細胞HCM的保護作用，提示Rottlerin可能通過調控miR-204-5p保護心肌細胞免受損傷。

HMGB1是HMG蛋白家族成員之一，一種重要的損傷相關的分子識別模式［28］；在眾多的心血管疾病如急性冠脈綜合征、缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病中有重要的促炎作用［29］。研究發現，HMGB1在損傷心肌細胞中高表達，CORM-2通過下調HMGB1的表達可減輕心肌細胞缺氧損傷［30］。缺氧復氧誘導心肌細胞合成HMGB1，敲低HMGB1可以減弱缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡，減輕氧化損傷［31］。GLP-1受體激動劑通過抑制HMGB1的表達保護高糖誘導的心肌損傷［32］。抑制HMGB1可降低機體各種炎癥因子水平，調控膿毒癥的失控性炎癥效應，減輕膿毒癥心肌損害［33］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路的激活介導HMGB1減輕心肌缺血再灌注損傷，對心肌產生保護作用，其保護機制或是抑制炎癥反應、減輕氧化應激、抑制心肌細胞凋亡［34］。上調miR-451通過抑制HMGB1 mRNA表達保護心肌細胞缺氧再復氧損傷［35］。本研究結果顯示，HMGB1受miR-204-5p的調控，過表達HMGB1能逆轉Rottlerin對LPS作用的心肌細胞HCM的保護作用。

綜上所述，粗糠柴毒素對LPS所致的心肌細胞損傷有保護作用，其機制可能是通過上調miR-204-5p的表達，進而抑制HMGB1的表達而發揮作用。粗糠柴毒素在治療心肌損傷方面具有一定的治療潛力，miR-204-5p和HMGB1可能是心肌損傷治療的潛在靶點。