溫陽生肌凝膠中揮發油提取與包合工藝研究

胡青，黃莉，唐林，陳麗，戴冰，肖望重

作者單位：1湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，湖南 長沙 410007；2湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410001

溫陽生肌凝膠為湖南中醫藥大學第一附屬醫院燒傷瘡瘍整形科的臨床經驗方，由肉桂、丁香、乳香、沒藥組成，具有溫陽行氣，去腐生肌功效，臨床上常用于治療各種慢性皮膚潰瘍［1-2］。現代藥理研究表明該四味藥中的揮發油具有抗菌消炎、抗潰瘍與促進創面修復等作用［3-6］，故揮發油為該制劑的主要有效成分之一。然而，揮發油物理性質不穩定，容易揮發，給生產與儲存帶來諸多不便，因此，為提高揮發油在凝膠中的穩定性，確保溫陽生肌凝膠臨床療效，2021年3—6月，本研究以君藥肉桂中揮發性成分桂皮醛為指標成分，建立了桂皮醛的含量測定方法，并采用正交試驗法對該制劑的揮發油提取與β-環糊精包合工藝進行了優化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥1260 InfinityⅡ型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、LC1260色譜工作站（美國Agi?lent公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；AUW220D型萬分之一電子分析天平（上海海鴻儀器有限公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

桂皮醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110710~201821）；β-環糊精（上海源葉生物科技有限公司，批號Z30M10Y89545），乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。肉桂（批號20061331D）由江蘇龍鳳堂中藥有限公司提供；丁香與乳香由湖南新匯制藥股份有限公司提供；沒藥由湖南衡岳中藥飲片有限公司提供，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院張志國教授鑒定，肉桂為樟科植物肉桂的干燥樹皮、丁香為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾、乳香為橄欖科植物乳香樹及同屬植物樹皮滲出的樹脂、沒藥為橄欖科植物地丁樹.或哈地丁樹的干燥樹脂。

1.2 方法

1.2.1 桂皮醛含量測定

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相∶乙腈-水（40∶60，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：290 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

1.2.1.2 對照品溶液制備 采用減量稱重法，精密稱取桂皮醛對照品28.4 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成質量濃度為1.136 0 g/L的對照品溶液

1.2.1.3 供試品溶液制備 根據處方要求，稱取肉桂、丁香、乳香、沒藥適量，按《中國藥典》2020版四部揮發油測定法（甲法）提取5 h，收集揮發油。量取揮發油3 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，濾過，取續濾液，既得。

1.2.1.4 陰性樣品溶液制備 根據處方要求，稱取缺肉桂的其他樣品各適量，按“1.2.1.3”項方法制備陰性樣品溶液。

1.2.1.5 空白對照溶液 以甲醇為空白對照溶液。

1.2.2 系統適用性試驗 取上述空白對照溶液、對照品溶液、供試品溶液以及陰性樣品溶液各適量，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，可見桂皮醛色譜峰分離度為3.64，理論塔板數為7 296，且與其他成分峰基線分離，空白對照溶液與陰性樣品溶液對測定無干擾，色譜圖結果見圖1。

圖1 桂皮醛含量測定系統適用性試驗高效液相色譜圖：A為空白溶劑；B為對照品；C為樣品；D為陰性樣品

1.3 統計學方法數據分析使用SPSS 25.0進行處理，實驗數據用±s表示，采用多因素方差分析和獨立樣本t檢驗進行差異比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 線性關系考察取“1.2.1.2”項下對照品溶液1μL、2μL、4μL、8μL、10μL，按照“1.2.1.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積。以對照品進樣質量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，結果回歸方程為Y=392.57X-376.67（r=0.999 5），桂皮醛檢測進樣量線性范圍為1.136~11.36μg。

2.2 試驗及含量測定

2.2.1 精密度試驗 取“1.2.1.2”項下對照品溶液適量［7-8］，按“1.2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果桂皮醛峰面積RSD為1.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗 取上述四味藥材適量，共6份，分別按“1.2.1.1”項與“1.2.1.3”項下方法試驗，結果桂皮醛平均含量為6.67 mg/g，RSD為1.17%。

2.2.3 穩定性試驗 取“1.2.1.3”項下的同一份供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果桂皮醛峰面積RSD為1.46%（n=6），表明供試品溶液置于室溫中24 h內穩定。

2.2.4 加樣回收試驗 精密稱取上述四味藥材，分別精密加入桂皮醛對照品6.816 0 mg，按“1.2.1.3”項制備供試品溶液，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平均回收率為99.58%，RSD值為1.31%，表明該法準確性良好，結果見表1。

表1 桂皮醛加樣回收率試驗結果（n=6）

2.2.5 含量測定 取上述四味藥材各適量，共9份，分別按“1.2.1.1”項與“1.2.1.3”項下方法試驗，結果，桂皮醛含量范圍為3.251 7~7.175 6 mg/g。

2.3 揮發油提取工藝研究

2.3.1 正交實驗設計 結合相關文獻報道與預試驗結果［9-11］，選擇藥材浸泡時間、加水量、提取時間為考察因素，每個因素設置3個水平，以桂皮醛含量與揮發油得率為考察指標（綜合評分中桂皮醛含量與揮發油得率的權重系數分別為0.7、0.3，即綜合評分=桂皮醛含量/最大桂皮醛含量×70%×100+揮發油得率/最大揮發油得率×30%×100），選用L9（34）正交表進行試驗。其中因素水平見表2，試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。

表2 肉桂揮發油提取工藝研究因素水平

表3 肉桂揮發油提取工藝試驗設計與結果

表4 肉桂揮發油提取工藝方差分析

2.3.2 結果分析 由正交試驗與方差分析結果可知，所選因素中對揮發油提取的影響程度大小分別是C>B>A，即提取時間>加水量>浸泡時間，其中因素C對提取工藝有顯著性影響（P<0.05），因素A、B無顯著性影響，結合實際生產情況與成本控制，認定最優揮發油提取工藝為A1B1C3，即加8倍量水，浸泡30 min，提取8 h。

2.4 揮發油包合工藝研究

2.4.1 包合物制備方法選擇 目前揮發油包合常用方法為飽和水溶液法與研磨法［12-14］，因此以揮發油包合率與收得率為考察指標，分別對飽和水溶液法與研磨法進行考察，其中空白包合率（%）=回收揮發油量（mL）/加入揮發油量（mL）×100%，包合率（%）=包合物含油量（mL）/［包合物加油量（mL）×空白回收率（%）］×100%；收得率（%）=包合物重量（g）/［β-環糊精重量（g）+揮發油重量（g）］×100%。結果研磨法與飽和水溶液法包合率分別為（67.61±0.95）%、（51.63±1.35）%，t=13.68，P<0.001；研磨法與飽和水溶液法收得率分別為（79.40±0.73）%、（63.25±2.61）%，t=8.42，P=0.001，表明研磨法的包合率與收得率均高于飽和水溶液法，且均P<0.05，故選擇研磨法包合揮發油。

2.4.2 正交實驗設計 結合相關文獻報道與預試驗結果［15-16］，選擇β-環糊精投料比、加水量、研磨時間為考察因素，每個因素設置3個水平，以包合率與收得率為考察指標（綜合評分中包合率與收得率的權重系數均為0.5，即綜合評分=包合率/最大包合率×50%×100+收得率/最大收得率×50%×100），選用L9（34）正交表進行試驗。其中因素水平見表5，試驗設計與結果見表6，方差分析見表7。

表5 肉桂揮發油包合工藝因素水平

表6 肉桂揮發油包合工藝試驗設計與結果

表7 肉桂揮發油包合工藝方差分析

2.4.3 結果分析 由正交試驗與方差分析結果可知，所選因素中揮發油投料比（A）、加水量（B）、研磨時間（C）對包合效果均有顯著性影響，且影響程度大小分別是C>B>A，因此確定最優揮發油包合工藝為A3B2C3，即揮發油與β-環糊精比例為1∶10（mL∶g），加水量為5倍，研磨3 h。

2.4.4 驗證試驗 依照揮發油最優提取條件（A1B1C3）與最優包合條件（A3B2C3）進行平行試驗3次，結果見表8。

表8 肉桂揮發油提取與包合驗證試驗

2.5 揮發油包合物TLC鑒別取混合揮發油0.2 mL，加乙醇定容至1 mL量瓶中，為供試品溶液1；取包合物粉末1 g，共2份，一份加乙醇10 mL超聲提取30 min，靜置，濾過，取續濾液為供試品溶液2，另一份加乙醇10 mL振搖30 min，濾過，取續濾液為供試品溶液3；取β-環糊精粉末1 g，加乙醇10 mL振搖10 min，靜置，濾過，取續濾液為供試品溶液4；吸取上述供試品溶液各2μL，分別點樣于硅膠G薄層板上，以石油醚（60~90℃）∶乙酸乙酯（9∶1）飽和15 min后展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置105℃烘烤箱中加熱至斑點清晰，結果樣品1、2在相同位置顯示相同顏色的斑點，而樣品3、4未見任何斑點，表明包合物表面未殘留揮發油，且混合揮發油經β-環糊精包前后化學性質未發生明顯變化。

3 討論

溫陽生肌凝膠是在該院燒傷瘡瘍整形科主任周忠志教授所創的溫陽生肌方基礎上進行劑型改進而成，處方中各類藥物揮發油為該方的主要藥效部位之一，在藥物制備中應予以保留。目前部分揮發油的提取工藝優化考察指標為揮發油得率或揮發油含量［17-18］，該法存在考察指標單一，揮發性主要成分含量不可控等缺點，而本實驗采用雙指標綜合加權評價開展正交試驗研究，以君藥肉桂中揮發性成分桂皮醛為指標成分，建立了桂皮醛的含量測定方法，并結合揮發油得率對揮發油提取工藝進行優化，這樣既保障了揮發油得率，又對揮發性成分含量指標進行有效控制，比單一考察揮發油得率更加科學合理。

經文獻查詢，制劑過程中部分揮發油直接噴灑在藥材顆粒或粉末上，這樣既容易導致揮發油揮發，降低療效，也容易增加制劑的油性異味，且質量不可控［19-20］，因此本研究采用具有環狀中空圓筒結構且可被人體吸收的β-環糊精對揮發油進行包合，即可增加揮發油的穩定性和溶解度，又能提高藥物生物利用度，且該工藝操作簡便，穩定可行，適用于工業生產。β-環糊精包合揮發油的鑒別方法較多，本試驗采用常用的薄層色譜法進行驗證，結果提示揮發油包合后性質較穩定。

綜上所述，本研究優化所得的揮發油提取與包合工藝操作簡便，穩定可行，且重現性良好，該結果可為溫陽生肌凝膠后續研究開發與實際生產提供技術參考與理論依據。