三七總皂苷對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)素信號(hào)通路的影響

蘆君

作者單位：新汶礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，山東 泰安 271200

腦梗死又稱缺血性卒中，常常會(huì)伴隨大腦動(dòng)脈閉塞綜合征，是目前導(dǎo)致人類死亡和致殘的主要疾病之一［1-2］，主要通過溶栓治療、抗凝藥物治療等。當(dāng)然還可以選用中藥治療［3］。使用中藥治療具有副作用小、對(duì)病人其他器官損傷較小的特點(diǎn)。三七總皂苷是三七有效成分之一，三七味苦，微甘，可活血、祛瘀，還參與血小板聚集、心腦血流量調(diào)節(jié)過程［4］。丁巖等［5］研究表明：三七總皂苷可以減輕炎癥反應(yīng)，清除氧自由基，減輕線粒體損傷的作用。三七總皂苷可以作為緩解腦梗死損傷的有效中藥，但目前關(guān)于三七總皂苷通過Wnt/β-連環(huán)素（β-catenin）信號(hào)通路影響腦梗死的研究尚沒有報(bào)道。本研究于2018年1月至2019年3月觀察三七總皂苷對(duì)腦梗死大鼠模型影響，以期了解三七總皂苷對(duì)腦梗死大鼠模型神經(jīng)細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物60只SPF級(jí)3周齡雄性SD大鼠由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［粵監(jiān)證字2004A029號(hào)，SCXK（粵）2018-0008］，體質(zhì)量（60±5）g，所有大鼠均在新汶礦業(yè)集團(tuán)有限公司中心醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)（20~25℃，人工光照12 h/d，黑暗12 h/d，50%~65%空氣濕度，自由飲食），本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 藥物與試劑三七總皂苷購自湖北省中醫(yī)院；自噬蛋白P62抗體（貨號(hào)sc-48389；批號(hào)20190602）購自美國Santa Cruz公司；Wnt信號(hào)通路配體蛋白Wnt3a抗體（貨號(hào)ab81484；批號(hào)20190201）購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶羊標(biāo)記抗兔免疫球蛋白G（IgG）等二抗購自美國Thermo公司。

1.3 儀器臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16M購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Thermo Fish?er公司。

1.4 方法

1.4.1 分組及建立模型 各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，以隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠均分為空白對(duì)照組、模型組、低劑量三七總皂苷組和高劑量三七總皂苷組，每組各15只，將模型組、低劑量三七總皂苷組和高劑量三七總皂苷組大鼠制成腦梗死模型［6］。空白對(duì)照組僅僅暴露大鼠頸動(dòng)脈，不適用尼龍繩阻斷大鼠供血。

1.4.2 藥物干預(yù) 低劑量三七總皂苷組造模成功后2 h腹腔注射三七總皂苷，注射劑量按照75 mg/kg注射，將其稀釋呈0.5 mL，每日注射1次，連續(xù)注射3 d；高劑量三七總皂苷組造模成功后2 h腹腔注射三七總皂苷，注射劑量按照150 mg/kg注射，將其稀釋呈0.5 mL，每日注射1次，連續(xù)注射3 d；空白對(duì)照組和模型組造模成功后2 h腹腔注射等量的生理鹽水，每日注射1次，連續(xù)注射3 d，三七總皂苷注射劑量參考林輝［7］研究結(jié)論。

1.4.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組大鼠完成最后一次給藥24 h后，用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）［8］評(píng)定大鼠神經(jīng)功能，神經(jīng)功能輕度損害受損分?jǐn)?shù)為1~6分，神經(jīng)中度受損評(píng)分為7~12分，神經(jīng)重型受損評(píng)分為13~18分。

1.4.4 大鼠姿勢(shì)反射評(píng)分 完成大鼠mNSS評(píng)分2 h后，使用Z-Longa評(píng)分［9］評(píng)定大鼠姿勢(shì)反射情況。

1.4.5 大鼠腦梗死率及腦含水率檢測(cè) 完成神經(jīng)評(píng)分后處死大鼠，取腦于-20℃環(huán)境20 min后行冠狀切成（厚度2 mm），腦片置于2%2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液避光反應(yīng)30 min后拍照，Image-ProPlus軟件對(duì)腦梗死區(qū)域（白色區(qū)域）、正常區(qū)域（紅色區(qū)域）的總面積進(jìn)行分析計(jì)算，腦梗死率（%）=（梗死區(qū)總面積/全腦總面積）×100%。各組大鼠左右腦半球分離，快速稱質(zhì)量（濕質(zhì)量），隨后放入90℃恒干燥箱干燥，時(shí)間為24 h，取出后稱質(zhì)量（干質(zhì)量），腦含水率（%）=［（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量］×100%。

1.4.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 提取腦部組總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離，再轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，添加Wnt3a、β-catenin、LC3-Ⅱ、P62、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，化學(xué)顯影曝光并收集圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 22.0，計(jì)量資料以±s表示，多組間采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損及姿勢(shì)反射評(píng)分結(jié)果與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠mNSS評(píng)分、大鼠姿勢(shì)反射評(píng)分升高（P<0.05）；各組大鼠mNSS評(píng)分、大鼠姿勢(shì)反射評(píng)分比較見表1。

表1 各組大鼠mNSS及姿勢(shì)反射評(píng)分結(jié)果比較/（分，±s）

表1 各組大鼠mNSS及姿勢(shì)反射評(píng)分結(jié)果比較/（分，±s）

注：mNSS為改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分。①與空白對(duì)照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與低劑量三七總皂苷組相比，P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組低劑量三七總皂苷組高劑量三七總皂苷組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 mNSS 0.75±0.20 14.21±1.25①8.52±0.75②4.21±0.78②③729.19<0.001大鼠姿勢(shì)反射評(píng)分0.21±0.09 3.20±0.25①2.10±0.22②1.20±0.15②③689.48<0.001

2.2 腦梗死率及腦含水率檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照組相比，模型組腦梗死率、腦含水率升高（P<0.05）；與模型組相比，低、高劑量三七總皂苷組大鼠腦梗死率、腦含水率降低（P<0.05）；且高劑量組降低更明顯（P<0.05）。見表2，圖1。

表2 各組大鼠腦梗死率及腦含水率結(jié)果比較/（%，±s）

表2 各組大鼠腦梗死率及腦含水率結(jié)果比較/（%，±s）

注：①與空白對(duì)照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與低劑量三七總皂苷組相比，P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組低劑量三七總皂苷組高劑量三七總皂苷組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15腦梗死率2.00±0.10 65.00±7.00①42.00±10.00②28.00±9.00②③181.28<0.001腦含水率75.30±3.20 85.98±4.20①80.73±2.10②76.12±1.90②③30.04<0.001

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織P62蛋白表達(dá)水平降低，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組相比，低、高劑量三七總皂苷組大鼠腦組織P62蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；與低劑量三七總皂苷組相比，高劑量三七總皂苷組大鼠腦組織P62蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表3，圖2。

表3 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較/±s

表3 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較/±s

注：P62為自噬蛋白，LC3-Ⅱ?yàn)槲⒐芟嚓P(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ。①與空白對(duì)照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與低劑量三七總皂苷組相比，P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組低劑量三七總皂苷組高劑量三七總皂苷組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 P62 1.80±0.20 0.45±0.09①1.00±0.15②1.35±0.20②③176.31<0.001 LC3-Ⅱ0.25±0.06 1.85±0.25①0.98±0.11②0.72±0.11②③299.85<0.001

圖2 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果

2.4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織Wnt 3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；與模型組相比，低、高劑量三七總皂苷組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），且高劑量三七總皂苷組更高（P<0.05）。見表4，圖3。

圖3 各組大鼠冠狀位大腦切片2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）染色

表4 各組大鼠Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)比較/±s

表4 各組大鼠Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)比較/±s

注：Wnt3a為Wnt信號(hào)通路配體蛋白，β-catenin為β-連環(huán)素。①與空白對(duì)照組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與低劑量三七總皂苷組相比，P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組低劑量三七總皂苷組高劑量三七總皂苷組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 Wnt3a 1.68±0.25 0.25±0.09①0.79±0.15②1.26±0.25②③146.08<0.001 β-catenin蛋白1.55±0.20 0.40±0.10①0.90±0.15②1.23±0.25②③107.23<0.001

圖3 各組大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果

3 討論

腦梗死往往會(huì)出現(xiàn)腦組織水腫和炎癥反應(yīng)，是因?yàn)榇竽X缺血后活化的中性粒細(xì)胞可釋放大量的毒性氧自由基和蛋白水解酶，導(dǎo)致局部腦血管損傷，使得通透性增大。引起腦組織水腫［10］。同時(shí)中性粒細(xì)胞釋放的毒性物質(zhì)還可進(jìn)一步破壞幸存的神經(jīng)細(xì)胞，加重腦組織損傷形成惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，使用三七總皂苷治療后大鼠mNSS評(píng)分、大鼠姿勢(shì)反射評(píng)分降低。有研究表明三七總皂對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦水腫、腦梗死有改善作用［11］。本研究也呈相似趨勢(shì)，說明大鼠的神經(jīng)功能得到改善，這可能是因?yàn)槿呖傇碥湛赏ㄟ^減輕腦梗死區(qū)炎癥反應(yīng)并抑制腦梗死區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤，減少中性粒細(xì)胞釋放的毒性物質(zhì)破壞神經(jīng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)緩解大鼠腦組織水腫情況達(dá)到治療大鼠腦梗死。

P62不僅參與泛素化過程，還在細(xì)胞自噬調(diào)控［12］，其表達(dá)水平越高提示自噬水平越弱［13］。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3是哺乳動(dòng)物的自噬基因［14］，當(dāng)自噬活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)自噬體的數(shù)目就會(huì)增加，微管相關(guān)蛋白輕鏈3-I會(huì)和更多的自噬細(xì)胞膜結(jié)合形成LC3-Ⅱ，隨著自噬過程的進(jìn)展，自噬體外膜會(huì)與溶酶體膜融為一體，溶酶體內(nèi)的酶就會(huì)降解LC3-Ⅱ蛋白［15］。Wnt信號(hào)通路是細(xì)胞自噬重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Wnt信號(hào)可以磷酸化糖原合成酶激酶3β，促進(jìn)結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物蛋白1/結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物蛋白2復(fù)合物形成，以減少哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白的降解，從而抑制自噬的發(fā)生［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用三七總皂苷后可以降低腦梗死大鼠LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，增加P62蛋白表達(dá)，可能是三七總皂苷通過某些途徑使得P62表達(dá)降低，影響自噬小體形成，使得大鼠腦組織中的自噬體降低，減輕大鼠的自噬。

耿武軍等［17］研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過調(diào)控自噬改善腦梗死大鼠的神經(jīng)損傷，Wnt信號(hào)通路在調(diào)控成年動(dòng)物大腦中的神經(jīng)再生中起關(guān)鍵性作用，Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路［18］。人參皂苷含有Rg1、Rb1、Re、Rd等多種皂苷成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明三七總皂苷具有抗氧化、抑制炎癥的效果［19］。人參皂苷通過抑制相關(guān)炎性介質(zhì)核因子κB的激活抑制腦梗死大鼠腦部的炎癥反應(yīng)，同時(shí)通過抗氧化作用促進(jìn)Wnt/βcatenin信號(hào)通路的活化使血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶表達(dá)增多，從而使細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子FoxO相關(guān)分子移位于細(xì)胞質(zhì)，減少轉(zhuǎn)錄因子FoxO信號(hào)通路下游相關(guān)促細(xì)胞凋亡基因的產(chǎn)生，從而影響大鼠腦細(xì)胞凋亡。三七總皂苷促進(jìn)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，并促進(jìn)了β-catenin的表達(dá)，高濃度的β-catenin能進(jìn)入細(xì)胞核與巴增強(qiáng)因子/T-細(xì)胞因子（Lef/Tcf）家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)肝細(xì)胞向不可再生的神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化，補(bǔ)充凋亡的神經(jīng)細(xì)胞［20］。本研究發(fā)現(xiàn)使用三七總皂苷后大鼠腦組織Wnt3a蛋白和β-catenin蛋白表達(dá)水平升高。王飛等［21］研究表明通過影響Wnt基因表達(dá)可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，達(dá)到改善神經(jīng)功能的作用，本研究結(jié)果中大鼠的神經(jīng)功能得到恢復(fù)推測(cè)與此有關(guān)。

綜上所述，三七總皂可緩解腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷，其作用機(jī)制可能與激活wnt/β-catenin信號(hào)通路、抑制神經(jīng)元細(xì)胞自噬有關(guān)，在后期的實(shí)驗(yàn)中將深入探討三七總皂的劑量使用對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能的作用效果。