便攜式近紅外光譜儀的僵蠶快速檢驗應用研究

鐘紅，駱勇，石志強，鐘家瓊，王蛟龍，吳丙滔，歐家林，于婭，彭長恩

作者單位：成都市郫都區中醫醫院中藥房，四川 成都 611730

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶4~5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌而致死的干燥體，其主產于我國四川、江蘇、浙江、廣東、廣西等地［1］。僵蠶是中國、日本、韓國等國的傳統動物藥，臨床上廣泛使用于治療驚厥、癲癇、咳嗽、哮喘、頭痛、皮膚瘙癢等多種病癥［2-3］。僵蠶生品氣味、藥性較強，臨床用藥多選用僵蠶炮制品麩炒僵蠶，其具有祛風解痙、化痰散結的功效［4］。僵蠶作為常用動物藥之一，有研究對部分中醫院飲片使用量進行了調查，其中僵蠶的用藥量在動物類飲片中名列前茅［5］。由于其市場需求量逐年增加，市場上藥材正偽品混雜，生品與制品共存，不同產地藥材質量與療效也具有一定差異。其中，僵蠶養殖的環境飾變作為其品質影響要素之一顯得尤為重要，其中的氣候因素、生物因子均對藥材品種具有較強影響作用［6］。此外，僵蠶的麩炒炮制方法也經現代研究證實了其科學性與合理性，經過麩炒后的僵蠶蛋白質含量下降，黃曲霉素已被去除，達到了緩和藥性，增加用藥安全性的目的［7］。目前常用現代分析技術如高效液相色譜法（HPLC）等方法測定僵蠶中草酸銨、白僵菌素以及醇溶性浸出物等成分含量，以此完成僵蠶藥材品質評價，上述方法雖然檢測準確度高，但耗時長，預處理復雜，不適用于藥材的現場快速分析［8-9］。

目前，近紅外光譜分析技術作為一種新興的快速檢測方法，因其無須樣本預處理、操作簡便、適用于大批量樣本實時檢測等優點，被廣泛應用于中藥分析領域［10］。在動物類中藥材分析領域中，已有近紅外技術成功應用于阿膠［11］、地龍［12］、金銀花［13］等藥材質量評價的文獻報道。相比于臺式近紅外光譜儀，便攜式近紅外技術作為一種新型的定性及定量分析近紅外技術，具有現場、實時分析的優勢，彌補了近紅外技術在現場分析領域的空白，經過多年來化學計量學方法以及硬件性能的提升，便攜式近紅外光譜儀也已在中藥分析領域初步嶄露頭角［14-18］。目前尚未有近紅外技術應用于僵蠶的研究報道，本研究于2021年2—3月采用便攜式近紅外光譜儀對僵蠶的產地以及僵蠶炮制前后的差異進行近紅外分析，建立一種實時鑒別不同產地僵蠶與炮制品的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器便攜式近紅外光譜儀（PV500R-I，中國長虹科技有限公司）；FA224型精密電子天平（上海一科科學儀器公司）；SF-130C型高速中藥粉碎機（湖南中誠制藥機械廠）；DB-206SC型電熱鼓風恒溫干燥箱（成都天宇試驗設備有限責任公司）；Unscram?bler?X10.4軟件（CAMO software，Oslo，Norway）。

1.2 材料僵蠶經成都中醫藥大學吳純潔研究員鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶4~5齡的幼蟲感染白僵菌致死的干燥體及其炮制品。50℃低溫烘干至恒重，粉碎，過三號篩。僵蠶及其炮制品麩炒僵蠶來源和數量信息，見表1。

表1 僵蠶及其炮制品麩炒僵蠶來源和數量信息

1.3 樣本近紅外光譜采集將每批樣本稱取20.0 g后平鋪放置于直徑為10 cm、高為5 cm的不透光圓柱形鐵盒中，采用PV500R-I便攜式近紅外光譜儀采集樣本光譜，其光斑大小為10 mm，光譜分辨率為6 nm，重復性2 nm，掃描次數36次，波長范圍為1 551~2 150 nm。將便攜式近紅外光譜儀平貼于樣本表面，同一樣本以多個采樣點進行采樣，每采集一次后更換儀器放置區域繼續采集樣本光譜，每個樣本采集3次光譜后求平均光譜用于后續建模分析。

1.4 不同光譜預處理方法通過對樣本近紅外光譜數據采取適宜的預處理方法，可以有效去除光譜中包含的噪聲信息，保留特征信息，提高所建模型的性能。目前常用的光譜預處理方法主要有平滑、一階與二階求導、多元散射校正（MSC）與標準正態變量校正（SNV）等，平滑預處理光譜后可減少光譜的背景噪聲［19］；對光譜數據一階與二階求導后可提升光譜分辨率和靈敏性，其工作原理為消除基線和其他背景的干擾［20］；而MSC與SNV作用相同，可消除樣本顆粒對光譜數據產生的影響［21-22］。在Un?scrambler軟件中選擇上述方法分別對僵蠶樣本原始光譜進行預處理。

1.5 化學計量學方法

1.5.1 主成分分析（PCA）是一種無監督的模式識別方法，利用其降維能力從多個變量中得到可代表樣本最大限度特征的幾個主成分，從而對樣本的分布及聚類特征進行描繪［23］。本研究利用Unscrambler軟件對不同產地僵蠶及麩炒僵蠶建立PCA模型，以發掘不同產地樣本及其炮制品之間的聯系與區別。

1.5.2 線性判別分析（LDA）在PCA的基礎上，采用有監督的LDA方法對僵蠶產地進行區分。LDA在已知樣本類別標簽的情況下尋求樣本分類的最優解，可達到更好的分類效果［24］。在Unscrambler軟件中采用LDA建立不同產地僵蠶的近紅外定性分析模型，以準確率為模型指標以評估模型預測性能。

2 結果

2.1 樣本的近紅外光譜84批不同產地僵蠶及24批麩炒僵蠶樣本的近紅外原始光譜以及采用不同光譜預處理方法得到的樣本光譜如圖1所示。

圖1 僵蠶及麩炒僵蠶樣品近紅外光譜圖：SNV為標準正態變量校正；MSC為多元散射校正

2.2 不同類別僵蠶樣品的PCA模型根據比較不同光譜預處理方法分析結果，選擇利用一階導數處理后的光譜建立PCA模型，前7個主成分的累計解釋了樣本變量信息97.82%的方差，其中第1主成分方差貢獻率為69.53%，第2主成分方差貢獻率為17.43%，第3主成分方差貢獻率為5.95%，前3個主成分累計方差貢獻率為92.91%，代表其可很好地解釋樣品光譜信息。不同產地僵蠶樣本及麩炒僵蠶的近紅外原始光譜數據PCA模型結果如圖2所示。從圖2中可以看出，僵蠶的炮制品與其生品之間具有明確區分，可明顯分為兩類。此外，3個產地的僵蠶樣本各自聚為一類，雖然3個產地樣本之間具有部分重疊，但通過對主成分聚類圖的可視化分析也可實現不同產地僵蠶樣本的明確區分。

圖2 不同產地僵蠶與麩炒僵蠶的主成分分析（PCA）聚類圖

2.3 LDA模型區分僵蠶產地采用Kennard-Stone（K-S）算法［25］對樣本進行劃分，84批不同產地僵蠶樣本按照3∶1比例，劃分為含有63批樣本的校正集，用于建立校正模型；剩余的21批樣本作為驗證集用于評估模型預測性能。

2.3.1 不同光譜預處理方法 采用不同光譜預處理方法分別建立不同產地僵蠶的近紅外定性分析模型，不同光譜預處理方法所建模型的結果如表2所示。根據結果可知，采用平滑預處理方法對光譜進行預處理后，模型的校正集與驗證集結果更優，因此選擇平滑后的光譜建模。其中校正集樣本的判別準確率為98.41%，驗證集樣本的判別準確率為90.48%；校正集中只有江蘇一類樣本有一個判別錯誤，其余的四川、廣西兩類產地的判別正確率均為100%；驗證集中江蘇與四川兩個產地各有一個樣本預測錯誤，產自廣西的樣本的預測正確率依然為100%。

表2 不同光譜預處理方法僵蠶產地建模結果/%

2.3.2 不同產地僵蠶LDA模型 平滑預處理后光譜建立的不同產地僵蠶LDA模型聚類圖如圖3所示，三個產地的僵蠶具有明顯的聚類與分離趨勢，大致分為三類。其中產自江蘇的一類樣本聚集趨勢最強，而產自四川的一類樣本中有少數樣本較為分散，可能與樣本批次以及更細致的產地分布有關。通過LDA聚類圖的可視化分析，可對不同產地僵蠶進行明確的區分，表明建立的不同產地僵蠶定性分析模型可對僵蠶產地進行準確區分。

圖3 不同產地僵蠶樣本的近紅外光譜線性判別分析（LDA）聚類圖

2.4 LDA模型鑒別僵蠶及其炮制品利用LDA方法建立僵蠶生品與炮制品的近紅外定性分析模型，同樣利用K-S算法對僵蠶24批麩炒僵蠶進行樣本集劃分，其中校正集18批，驗證集6批；其余僵蠶生品按照2.3項下樣本集劃分；共得到校正集樣本81份，驗證集樣本27份。

2.4.1 不同光譜預處理方法 評估上述多種光譜預處理方法多所建僵蠶生品與炮制品的近紅外定性分析模型性能的影響，不同光譜預處理方法所建模型的結果如表3所示。從表3結果可看出，多種光譜預處理方法所建的僵蠶生品與炮制品近紅外定性分析模型的性能相同，校正集與驗證集的判別準確率均達到100%，表明僵蠶生品與炮制品的區別較大，多種光譜預處理方法建立的模型均能對僵蠶與麩炒僵蠶進行準確區分。

表3 不同光譜預處理方法僵蠶生品與炮制品建模結果/%

2.4.2 僵蠶與麩炒僵蠶LDA模型 根據結果可知，原始光譜與其余預處理方法預處理光譜所建模型性能相當，本著最少處理原則，選擇原始光譜建模。建立了僵蠶與麩炒僵蠶的近紅外定性分析模型，模型的LDA聚類圖如圖4所示。從圖中可看出，僵蠶與其炮制品麩炒僵蠶具有明顯區別，在可視化分析中明確聚為兩類，麩炒僵蠶位于LDA聚類圖左上側，僵蠶樣本則位于聚類圖右下側，顯示出了樣本間的明確分離趨勢以及樣本內的聚集趨勢，充分表明僵蠶經炮制后其內在成分具有顯著變化，導致其以內在成分為代表的近紅外光譜數據的較大差異。通過便攜式近紅外光譜儀建立的僵蠶生品與炮制品麩炒僵蠶的近紅外定性分析模型，可對兩類僵蠶樣本進行明確區分。

圖4 僵蠶與麩炒僵蠶的近紅外光譜線性判別分析（LDA）聚類圖

3 討論

研究共采用84批僵蠶樣本以及24批僵蠶的炮制品麩炒僵蠶樣本，通過利用國產的新型便攜式近紅外光譜儀對僵蠶的產地，生品與炮制品分別進行近紅外定性建模分析。在全波段、一階預處理條件下，利用PCA模型可基本實現不同產地僵蠶以及麩炒僵蠶樣本的區分，三個產地的僵蠶樣本之間以及麩炒僵蠶具有明顯不同。在建立的僵蠶產地近紅外LDA模型中，結果顯示，經平滑預處理后建立的模型效果最佳，校正集中三個產地僵蠶樣本的判別準確率為98.41%，驗證集的預測正確率也達到了90.48%，表明該模型可對不同產地樣本進行準確區分；在建立的僵蠶生品與麩炒僵蠶的近紅外分析模型中，多種光譜預處理方法均達到校正集、驗證集同為100%的判別、預測正確率，表明僵蠶生品與其炮制品具有較大差異，通過便攜式近紅外光譜儀可實現準確鑒別。與樣本預處理及分析往往需1 h以上且步驟繁瑣的傳統檢測方法相比，便攜式近紅外光譜儀可在5 min以內完成對無須預處理的僵蠶樣本光譜數據的采集及實時分析，為僵蠶藥材的現場快速評價提供了一種新的技術優勢。

本研究首次利用便攜式近紅外技術對僵蠶產地、炮制品進行了實時分析。隨著模型中樣本數量的增多以及更多具有代表性的樣本加入，模型的適用性、準確性以及應用范圍將進一步增大。相比傳統檢測方法以及HPLC等現代分析技術，便攜式近紅外技術實時、低成本的分析優勢為僵蠶藥材的質量控制提供了新的思路，也為其他動物類中藥材的近紅外快速評價體系的構建提供了借鑒。盡管如此，近紅外分析技術在中藥領域中的應用還存在一些不足有待完善：（1）近紅外模型的建立需要數量較多的具有代表性的樣本，而中藥內在成分復雜導致分析難度增大，模型的準確度對樣本數量的依賴嚴重。（2）近紅外光吸收強度弱，提取信息的有效利用率低，因此其儀器檢測的靈敏度、精確度還有待提升。綜上所述，近紅外技術在中藥分析領域雖存在一定的局限性，但隨著相關軟硬件、化學計量學、中藥分析技術的逐漸深入，近紅外技術在中藥分析領域將具有更廣闊的應用前景。