慢性乙型肝炎病人血清缺氧誘導因子1α水平及其診斷肝纖維化的價值

魏曉霞，周艷彩，卓亞，朱斌

作者單位：新鄉醫學院第一附屬醫院感染科，河南 新鄉 453100

慢性乙型肝炎（CHB）若不及時治療可逐漸進展到肝纖維化，目前肝組織學活檢仍是評估肝纖維化嚴重程度的金標準，但因其屬于有創檢查故而在臨床應用較為局限。Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原、透明質酸和層粘連蛋白（laminin，LN）是目前臨床上常用的反映CHB肝纖維化的血清學指標，但診斷肝纖維化的靈敏度和特異度不高［1-2］。因此，積極尋找無創診斷CHB肝纖維化的血清學標志物已經成為研究熱點。缺氧誘導因子1α（HIF-1α）是調節細胞參與缺氧反應的轉錄調控因子，研究證實HIF-1α能夠調控與肝纖維化相關基因的表達而參與肝纖維化的進展［3-4］。丁體龍等［5］采用免疫組化法檢測后發現HIF-1α在CHB病人肝臟組織中表達上調，但目前關于CHB病人血清中HIF-1α水平報道較少。本研究通過檢測CHB病人血清中HIF-1α表達水平并探討其診斷肝纖維化的臨床效能，為CHB病人肝纖維化的診斷、治療及動態檢測提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年6月至2019年1月于新鄉醫學院第一附屬醫院感染科住院治療的80例CHB病人作為研究對象。男38例，女42例，年齡（54.02±7.25）周歲，病程（16.07±6.33）年。納入標準：①CHB診斷明確，參考2015年中華醫學會肝病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》［6］；②肝臟穿刺組織學活檢結果完善；③納入研究時1年內未進行抗病毒和抗纖維化藥物治療。排除標準：①CHB近期急性加重者；②合并丙型、戊型、丁型肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷、肝癌等；③哺乳、妊娠及精神類疾病者；④3月內采用激素治療者。另納入30例健康體檢者作為對照組，男14例，女16例，年齡（53.14±7.62）周歲。兩組研究對象性別、年齡對比差異無統計學意義（P>0.05）。本研究中上述所有研究對象均知情同意且簽署知情同意協議書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化指標的檢查 所有研究對象入院時血清肝纖維化指標如PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN水平由該院檢驗科采用放射免疫法檢測。

1.2.2 CHB病人肝組織活檢CHB病人入院時經充分溝通并取得知情同意，在B超引導下行肝臟穿刺，取長度約為1 cm以上肝臟組織置入含有10%甲醛的EP管中送病理科待檢。參考文獻［7］，肝纖維化程度采用S0~S4分期評估，其中S0為無肝纖維化、S1~S2代表輕度肝纖維化、S3~S4代表中重度肝纖維化。

1.2.3 血清HIF-1α表達水平 所有研究對象均空腹抽取外周靜脈血5 mL，離心并獲取上層血清備用。血清HIF-1α水平采用酶聯免疫吸附測定（ELI?SA）試劑盒檢測，試劑盒購買自上海江萊生物科技有限公司（中國）。所有操作步驟均按照試劑盒說明書步驟進行。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布，以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以頻數表示，采用χ2檢驗；相關性檢驗采用Pearson相關性分析；以受試者操作特征曲線（ROC曲線）探討血清HIF-1α診斷肝纖維化的臨床效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHB病人肝臟活檢情況本研究80例CHB病人根據肝臟活檢情況分為S0組（20例）、S1~S2組（39例）、S3~S4組（21例），S0組、S1~S2組、S3~S4組及對照研究對象在性別和年齡上比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 對照組健康人和慢性乙型肝炎（CHB）組病人一般資料比較

2.2 CHB病人和對照組血清肝纖維化指標及HIF-1α水平分析S0組、S1~S2組、S3~S4組病人血清PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN及HIF-1α水平均顯著高于對照組（P<0.05）；S3~S4組病人血清PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN及HIF-1α水平均顯著高于S0組和S1~S2組（P<0.05）；S1~S2組病人血清PCⅢ、透明質酸、LN及HIF-1α水平均顯著高于S0組（P<0.05）。見表2。

表2 對照組健康人和慢性乙型肝炎（CHB）組病人血清肝纖維化指標及缺氧誘導因子1α（HIF-1α）水平的比較/（μg/L，±s）

表2 對照組健康人和慢性乙型肝炎（CHB）組病人血清肝纖維化指標及缺氧誘導因子1α（HIF-1α）水平的比較/（μg/L，±s）

注：PCⅢ為Ⅲ型前膠原，LN為層粘連蛋白，S0為無肝纖維化、S1~S2為輕度肝纖維化、S3~S4為中重度肝纖維化。①與對照組比較，P<0.05。②與S0組比較，P<0.05。③與S1~S2組比較，P<0.05。

組別對照組S0組S1~S2組S3~S4組F值P值例數30 20 39 21 PCⅢ7.12±2.31 25.02±8.45①34.25±7.11①②46.87±8.36①②③29.13<0.001Ⅳ型膠原7.65±2.42 25.71±6.33①28.14±7.29①40.36±8.93①②③35.01<0.001透明質酸21.96±5.15 42.68±9.37①56.82±10.03①②97.45±11.38①②③28.62<0.001 LN 8.81±2.24 26.38±6.98①32.65±7.44①②58.07±9.28①②③31.25<0.001 HIF-1α 35.69±7.25 46.37±9.15①60.31±10.02①②89.39±12.07①②③86.24<0.001

2.3 CHB病人血清HIF-1α與肝纖維化指標的相關性分析Pearson相關性分析結果顯示，CHB病人血清HIF-1α水平與PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸和LN均呈現顯著正相關性（P<0.05），相關系數分別為0.54，0.25，0.42，0.13。

2.4 CHB病人血清肝纖維化指標及HIF-1α水平診斷肝纖維化的價值以所有CHB病人血清HIF-1α、PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸和LN水平作為檢驗值，其中S0期為陰性，S1~S4期為陽性，繪制ROC曲線發現，HIF-1α診斷CHB病人發生肝纖維化的AUC為0.947，均顯著高于PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸和LN（Z=3.84，P<0.001；Z=3.98，P<0.001；Z=2.62，P=0.017；Z=2.85，P=0.008）。當HIF-1α的截斷值為71.26μg/L時，診斷靈敏度和特異度分別為92.36%和95.26%。見表3。

表3 慢性乙型肝炎（CHB）80例肝纖維化指標和缺氧誘導因子1α（HIF-1α）診斷肝纖維化的臨床效能

3 討論

肝纖維化是多種因素導致肝內肝星狀細胞（HSC）活化并大量增殖，肝組織內細胞外基質生成過多或降解減少導致肝臟內膠原蛋白過度沉積，最終引起肝組織結構或功能異常［8-10］。肝纖維化是CHB向肝硬化及肝癌發展的必經環節，同時，指南［6］及其他研究［11-13］也指出干擾素及核苷類藥物在一定程度上能夠改善甚至逆轉CHB肝纖維化，因此盡早評估CHB病人肝纖維化嚴重程度并積極治療對延長病人的生存周期具有極其重要的意義。盡管肝臟組織學活檢仍是診斷CHB肝纖維化的“金標準”，但其屬于一種有創檢查，存在出血及感染、無法動態監測CHB病人肝纖維化的嚴重程度及病理診斷醫師水平高低影響評估結果等多種缺點［14-15］，使其難以在臨床上廣泛應用，因此致力于積極尋找診斷CHB肝纖維化的標志物已經成為研究熱點。

HIF-1α是機體調節氧代謝的重要轉錄因子，近年來研究發現HIF-1α在肝纖維化的發病機制中扮演了重要作用，Moczydlowska等［4］在小鼠肝纖維化的肝臟組織中發現HIF-1α蛋白表達水平顯著升高，且與肝纖維化嚴重程度均呈現顯著正相關性；而Mesarwi等［16］進一步證實HIF-1α基因缺失的小鼠α-平滑肌肌動蛋白與Ⅰ型膠原蛋白表達水平顯著降低，而α-平滑肌肌動蛋白與Ⅰ型膠原蛋白與肝纖維化的發展密切相關［17］。此外，在機制上，Kim等［18］發現HIF-1α促進肝纖維化的發展可能與激活轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路有關，研究發現肝纖維化小鼠模型在采用TGF-β1型受體激酶抑制劑預處理后，能抑制HIF-1α誘導的TGF-β信號通路的激活，并顯著減少肝臟細胞外基質的沉積及肝纖維化程度；Wang等［19］采用絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）磷酸化抑制劑PD98059預處理HSC后發現，HIF-1α泛素化水平得到顯著提高并抑制HIF-1α易位到細胞核中，從而減少HSC的激活，提示HIF-1α促進肝纖維化的發展可能與抑制MAPK信號通路有關；肝纖維化的發生與肝內新生血管大量形成也具有顯著關系，血管內皮生長因子（VEGF）的上調與新生血管有關，在一項心肌梗死的動物研究中發現［20］，VEGF屬于HIF-1α的下游基因，HIF-1α能夠顯著增加VEGF的表達，因此推測HIF-1α通過增加VEGF的表達而參與肝纖維化的發生。

本研究發現，與對照組比較，CHB病人肝纖維化指標（PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN）及HIF-1α均有不同程度的升高，且在不同嚴重程度的肝纖維化病人中上述指標均存在顯著差異，說明隨著CHB病人肝纖維化嚴重程度的加重，4種臨床上常用的反映肝纖維化的指標PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN均顯著上升，此外，血清中HIF-1α水平也逐漸升高，這與丁體龍等［5］研究結果基本一致。相關性分析也顯示，CHB病人血清中HIF-1α水平與PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN均呈現顯著正相關性，提示HIF-1α可能在一定程度能夠反映CHB病人肝纖維化的嚴重程度。

為進一步驗證HIF-1α診斷CHB肝纖維化的臨床效能，本研究通過ROC曲線分析證實，血清HIF-1α診斷肝纖維化的臨床效能顯著，AUC高達0.947，為比較其他4種指標在診斷肝纖維化臨床效能的差異，我們發現PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN對診斷肝纖維化臨床效能同樣顯著，但HIF-1α的AUC顯著高于PCⅢ、Ⅳ型膠原、透明質酸、LN（P<0.05），且診斷靈敏度和特異度分別為92.36%和95.26%，說明HIF-1α可以成為診斷CHB肝纖維化的一種新的血清學標志物。

綜上所述，我們認為HIF-1α可能參與了CHB肝纖維化的發病機制，且與肝纖維化程度密切相關。血清中HIF-1α易于檢測，具有操作簡單、重復性強、便于動態觀察等多種優勢，可作為CHB病人肝纖維化治療好轉程度的指標，值得在臨床上推廣應用。此外，仍需要擴大樣本量進一步驗證我們的結果，同時開展大型隊列研究探討HIF-1α表達水平與CHB肝纖維化預后的關系，同時針對HIF-1α的靶向生物制劑也為治療CHB肝纖維化提供新視角。