老年重癥肺炎病人血清微小RNA-146a、微小RNA-223、微小RNA-21、微小RNA-124水平及其與預后的關系

郭云波，張曉萍，高崴崴，邵潤霞

作者單位：鄭州大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，河南 鄭州 450014

重癥肺炎在老年人中多有發生，其病死率較高，可造成多器官功能衰竭，預后差［1-2］。研究認為炎癥反應、微小RNA（microRNA，miRNA/miR）等與重癥肺炎病變過程有關［3-4］。miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124均是與炎癥相關的miRNA［5-7］；另外，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在重癥肺炎病人中呈高水平，經清肺保元湯與血必凈聯合治療后，其水平降低，TNF-α可能在重癥肺炎的病理發展中起促炎作用［8］。推測miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124可能在老年重癥肺炎病人血清中表達失調，且與預后及TNF-α等炎性因子有關。基于此，本研究分析老年重癥肺炎病人miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124與TNF-α及預后的關系，以期為臨床診治老年重癥肺炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年2月至2020年3月鄭州大學第二附屬醫院收治的老年重癥肺炎病人128例進行研究（重癥肺炎組），并納入同期收治的普通肺炎病人130例為普通肺炎組，同期體檢健康者128例為健康組。三組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 三組一般資料比較

納入標準：（1）重癥肺炎、普通肺炎病人分別符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》［9］中的重癥肺炎、普通肺炎診斷標準；（2）受試者檢查資料齊全；（3）年齡>60歲，認知溝通無障礙。排除標準：（1）伴有免疫、肝腎功能障礙者；（2）合并肺結核、腫瘤、肺纖維化者；（3）合并肺血管炎、肺不張者；（4）合并肺栓塞者、肺水腫者；（5）患有非感染性肺間質性疾病者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，受試者本人及其近親屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 收集重癥肺炎病人、普通肺炎病人入院后、治療前及健康者體檢當日外周血5 mL，靜置28 min，分離血清（4 700 r/min離心5 min）并分裝，-70℃超低溫冰箱儲存。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測血清miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124表達水平 冰上解凍血清，加cel-miR-39（用于校正miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124水平），TaqMan?miRNA ABC純化試劑盒（4473087，美國ABI）純化miRNA后，用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit（4366596，美國ThermoFisher）獲得互補DNA（cDNA），最后，用TaqMan?Universal PCR Master Mix（4304437，美國ThermoFisher）及熒光定量PCR儀（7500，美國ABI）擴增檢測目的基因（miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124），其相對表達量采用2-ΔΔCt法分析。各引物序列見表2。

表2 微小RNA（miR）-146a、miR-223、miR-21、miR-124、cel-miR-39引物序列

1.2.3 酶聯免疫吸附測定（ELISA）測定血清TNF-α水平 利用人TNF-αELISA試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司，ABE10038）及酶標儀（華粵企業有限公司，ELX808）按ELISA檢測血清TNF-α水平。

1.3 隨訪重癥肺炎病人接受常規內科治療，并依據細菌培養情況進行抗生素治療，記錄重癥肺炎病人28 d生存情況，以此分為生存組（77例）和死亡組（51例），并收集兩組重癥肺炎病人呼吸系統疾病史、吸煙史、氧分壓、高血壓病史、二氧化碳分壓、糖尿病病史、機械通氣等資料。

1.4 統計學方法以SPSS 25.0軟件分析數據。以±s表示計量數據，兩組間比較行兩獨立樣本t檢驗，三組間比較行單因素方分析，進一步多組間的兩兩比較行SNK-q檢驗；血清miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124、TNF-α對老年重癥肺炎病人預后的預測價值以受試者操作特征曲線（ROC曲線）評估；他們的表達水平與TNF-α的相關性用Pearson法分析；老年重癥肺炎病人死亡的影響因素用lo?gistic回歸法分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124表達水平及TNF-α水平比較與健康組相比，普通肺炎組、重癥肺炎組病人血清miR-146a、miR-223、miR-21表達水平及TNF-α水平升高（P<0.05），血清miR-124表達水平降低（P<0.05）；與普通肺炎組相比，重癥肺炎組病人血清miR-146a、miR-223、miR-21表達水平及TNF-α水平升高（P<0.05），血清miR-124表達水平降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組血清微小RNA（miR）-146a、miR-223、miR-21、miR-124表達水平及TNF-α水平比較/±s

表3 各組血清微小RNA（miR）-146a、miR-223、miR-21、miR-124表達水平及TNF-α水平比較/±s

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與健康組相比，P<0.05。②與普通肺炎組相比，P<0.05。

組別健康組普通肺炎組重癥肺炎組F值P值例數128 130 128 miR-146a 1.03±0.35 1.67±0.56①2.32±0.78①②153.03<0.001 miR-223 1.01±0.34 1.64±0.55①2.27±0.76①②153.14<0.001 miR-21 0.99±0.33 1.71±0.57①2.39±0.80①②175.36<0.001 miR-124 1.07±0.37 0.71±0.24①0.37±0.13①②222.79<0.001 TNF-α/（ng/L）5.43±1.84 12.78±4.30①23.64±7.92①②381.67<0.001

2.2 老年重癥肺炎病人血清miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124表 達 水 平 與TNF-α的 相 關 性Pearson法分析顯示，老年重癥肺炎病人血清miR-146a、miR-223、miR-21與TNF-α呈正相關（r=0.52、0.59、0.57，均P<0.001），血清miR-124表達水平與TNF-α呈負相關（r=-0.53，P<0.001）。

2.3 不同預后老年重癥肺炎病人一般資料及血清miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124、TNF-α水平比較與生存組相比，死亡組老年重癥肺炎病人血清miR-146a、miR-223、miR-21、TNF-α水平及有呼吸系統疾病史、吸煙史、機械通氣占比升高（P<0.05），血清miR-124表達水平、氧分壓水平降低（P<0.05），年齡、二氧化碳分壓及性別、有高血壓病史占比差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 不同預后老年重癥肺炎病人臨床資料和血清微小RNA（miR）-146a、miR-223、miR-21、miR-124、TNF-α水平比較

2.4 logistic回歸分析老年重癥肺炎病人死亡的影響因素以老年重癥肺炎病人是否死亡（是=1，否=0）為因變量，將“2.3”中差異有統計學意義的自變量納入logistic回歸分析，結果顯示，miR-146a、miR-223、miR-21、TNF-α、機械通氣是老年重癥肺炎病人死亡的危險因素（P<0.05）。見表5。

表5 影響老年重癥肺炎病人死亡的logistic回歸分析

2.5 血清miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124、TNF-α對老年重癥肺炎病人預后的預測價值ROC曲線顯示，血清miR-146a、miR-223、miR-21預測老年重癥肺炎病人預后的曲線下面積（AUC）分別為0.84、0.88、0.82，高于miR-124、TNF-α預測老年重癥肺炎病人預后的AUC（分別為0.66、0.68），具有較高診斷價值。見圖1，表6。

表6 各項指標對老年重癥肺炎病人預后的預測效能

圖1 血清miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124、TNF-α預測老年重癥肺炎病人預后的ROC曲線

3 討論

重癥肺炎是一種危重急癥，多發于老年人，且因老年人免疫力較低，多伴有基礎疾病，呼吸防御功能降低，治療老年重癥肺炎極為困難［10-11］，因此，尋找與老年重癥肺炎相關的機制，對早期干預，改善重癥肺炎病人預后有積極意義。

miRNA已成為診斷疾病的可靠標志物，其可影響信號轉導，參與炎癥反應，與肺癌、哮喘等肺部疾病關系密切［12-14］。研究發現，miR-146a在肺炎病兒中呈高表達，與TNF-α呈正相關，miR-146a可能通過調節炎癥水平進而參與肺炎病理發展［15］。本研究中miR-146a在肺炎病人中表達水平較高，與張薇等［15］研究趨勢一致，且老年重癥肺炎病人血清miR-146a水平更高，此外，死亡的老年重癥肺炎病人血清miR-146a水平高于生存者，提示miR-146a可能與老年重癥肺炎病理過程和預后相關，推測高水平miR-146a通過促進炎癥反應，進而影響老年重癥肺炎病情進展及預后。miR-223-3p是miR-223的成員之一，其在哮喘中表達水平升高，miR-223-3p可能通過調節內質網應激反應及信號轉導過程，影響炎癥水平，進而在哮喘中發揮作用［16-17］。本研究顯示，老年重癥肺炎病人血清miR-223水平高于普通肺炎病人、健康者，且死亡重癥肺炎病人血清miR-223表達水平高于生存者，提示miR-223可能在老年重癥肺炎發病進程中具有重要作用，與重癥肺炎病人預后有關，分析原因，高表達miR-223可能通過調節有關信號轉導過程，影響內質網應激及炎癥反應，從而在老年重癥肺炎病理過程中發揮促進作用。有關報道顯示，miR-21可通過靶向調控有關蛋白表達，進而影響肺部氣道重塑、氣道炎癥反應［18］；另外，miR-21在呼吸窘迫綜合征中過表達，其與炎癥水平關系密切，miR-21可作為判斷病兒病情嚴重程度及預后的指標［19］。本研究中老年重癥肺炎病人血清miR-21表達水平最高，且死亡老年重癥肺炎病人血清miR-21表達水平高于生存者，提示老年重癥肺炎病變進展可能與miR-21表達失調密切相關，推測高水平miR-21可能通過靶向調節相關蛋白表達，促進炎癥反應，從而影響老年重癥肺炎發生發展。此外，miR-124-3p是miR-124的一員，研究發現，miR-124-3p可通過與有關基因靶向結合，抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路激活，從而調節社區獲得性肺炎疾病進程［20］。本研究顯示，miR-124在肺炎病人中呈低表達，尤其在老年重癥肺炎病人中表達水平更低，且死亡病人血清miR-124表達水平低于生存者，提示miR-124水平降低可能與老年重癥肺炎病理發展及生存狀況相關，推測miR-124水平降低，其抑制NF-κB信號通路激活的作用減弱，炎癥反應增強，進而影響老年重癥肺炎病理變化。

TNF-α是一種炎性介質，其可激活淋巴細胞、中性粒細胞，促進其他炎性因子釋放，增加血管內皮細胞通透性，TNF-α在重癥肺炎病人中水平較高，其可能在重癥肺炎的炎癥反應過程中發揮作用［21-22］。本研究中老年重癥肺炎病人血清TNF-α水平最高，提示TNF-α水平升高可能與老年重癥肺炎病理進展相關。此外，老年重癥肺炎病人血清miR-146a、miR-223、miR-21與TNF-α呈正相關，血清miR-124表達水平與TNFα呈負相關，提示miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124可能與TNF-α共同影響老年重癥肺炎發生發展，推測miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124可能通過影響NF-κB等信號通路，調控TNF-α釋放，調節炎癥反應，從而在老年重癥肺炎中起作用，但其具體機制仍需進一步探討證實。高萍等［23］研究認為TNF-α可作為評估老年重癥肺炎病人預后的指標。本研究顯示，死亡重癥肺炎病人血清TNF-α水平高于生存者，提示TNF-α可能與老年重癥肺炎病人預后密切相關。進一步研究分析發現，血清miR-146a、miR-223、miR-21預測老年重癥肺炎病人預后的AUC分別為0.84、0.88、0.82，高于miR-124、TNFα，提示miR-146a、miR-223、miR-21有望成為評估老年重癥肺炎病人預后的潛在指標。此外，本研究顯示，死亡組老年重癥肺炎病人呼吸系統疾病史、吸煙史、機械通氣占比較高，氧分壓水平較低，且miR-146a、miR-223、miR-21、TNF-α、機械通氣是老年重癥肺炎病人死亡的危險因素，提示miR-146a、miR-223、miR-21、TNF-α表達水平升高，行機械通氣均可能會增加老年重癥肺炎病人死亡風險，臨床應及時監測上述指標，預防老年重癥肺炎病人死亡。

綜上所述，miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124在老年肺炎病人中表達失調，與疾病嚴重程度、炎性因子TNF-α水平及預后相關，且檢測血清miR-146a、miR-223、miR-21表達水平有利于臨床預測老年重癥肺炎病人的預后情況。但研究樣本較少，且未深入探究miR-146a、miR-223、miR-21、miR-124、TNF-α在重癥肺炎中的作用機制。