微小RNA-454、微小RNA-132、液泡膜-ATP酶表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征關(guān)聯(lián)性分析

孟利軍，朱艷麗，郭曉鶴，蒯君，楊璐，楊芳，秦詠梅

作者單位：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453100

我國(guó)新發(fā)惡性腫瘤疾病中結(jié)腸癌發(fā)病率為9.7%，在惡性消化道腫瘤中居第3位，每年以約120萬的速度呈逐年遞增趨勢(shì)［1-2］。研究顯示，結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、多因素參與的過程。微小RNA（miRNA/miR）是基因表達(dá)過程中重要調(diào)節(jié)因子，其異常表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤組織增生及轉(zhuǎn)移起著重要作用［3］。miRNA-132在肺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤中呈低表達(dá)趨勢(shì)，反之，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌中呈增高趨勢(shì)［4］。miR-454具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)作用。此外，實(shí)體腫瘤多處于缺氧、酸性微環(huán)境中，而腫瘤酸性微環(huán)境一定程度能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，提高化療耐藥性，而腫瘤組織中液泡膜-ATP酶（V-ATPase）表達(dá)過度或活性升高是形成腫瘤酸性微環(huán)境的主要原因之一［5］。但關(guān)于組織miR-454、miR-132、V-ATPase與結(jié)腸癌病人臨床病理特征關(guān)聯(lián)性仍有待驗(yàn)證。本研究嘗試綜合分析組織miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌病人臨床病理特征關(guān)聯(lián)性。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2011年9月至2014年11月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的96例結(jié)腸癌組織標(biāo)本、96例癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本、82例良性結(jié)腸病變標(biāo)本為研究對(duì)象，其中結(jié)腸癌組織標(biāo)本中，女49例，男47例；年齡（60.18±8.39）歲，范圍為35~80歲；其中Ducks分期［6］：37例A~B期，59例C~D期；49例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本中，女46例，男50例；年齡（59.87±7.93）歲，范圍為34~79歲。良性結(jié)腸病變標(biāo)本中，女39例，男43例；年齡（59.98±8.14）歲，范圍為33~82歲。3組性別（χ2=0.27，P=0.873）、年齡（F=0.50，P=0.780）均衡可比。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料均完整，并且病人及近親屬知情、簽署承諾書；均獲得長(zhǎng)期隨訪；（2）結(jié)腸癌組織及癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本：均經(jīng)結(jié)腸鏡、手術(shù)或組織病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌；（3）良性結(jié)腸病變標(biāo)本：均經(jīng)手術(shù)、組織病理學(xué)檢查證實(shí)為良性結(jié)腸病變；腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)在正常范圍內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌者；（2）合并其他部位惡性腫瘤者；（3）失語癥、認(rèn)知功能障礙或精神行為異常者。

1.2 方法主要試劑：RNA提取試劑盒、Taqman miRNA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司，DEPC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，乙醇、氯仿、異丙醇均購(gòu)自艾美捷科技有限公司。

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）：應(yīng)用RNA提取試劑盒提取結(jié)腸癌組織中RNA，并采用Taqman miRNA試劑盒檢測(cè)成熟體miR-454、miRNA-132的表達(dá)水平，實(shí)施qRT-PCR檢測(cè)。其中miR-454正向引物序列5’-TCCAGCT?GGGATCAACAGAC-3’，反向引物序列5’-TACCG?TAGCCGACTTGGACGCACC-3’；miR-132正向引物序列5’-TAACAGTCTACAGCCATGGTC-3’，反向引物序列5’-TGATCCGATCCACTATGC-3’；V-ATPase正向引物序列5’-ATGGCCAGATAGACAGC-3’，反向引物序列5’-CCATGGCTGCAAAGACGATG-3’。循環(huán)條件：預(yù)變性10 min（94℃），變性15 s（95℃），退火60 s（60℃），擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。均嚴(yán)格按照儀器說明書操作。實(shí)驗(yàn)中Ct檢測(cè)值在20~32之外的實(shí)施二次重復(fù)檢測(cè)。應(yīng)用公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)（1）對(duì)比結(jié)腸癌組織、良性結(jié)腸病變組織、癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本中miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)。（2）分析miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌病人一般資料、臨床病理參數(shù)的關(guān)系。（3）采用Spearman相關(guān)性分析miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌組織分化程度、Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。（4）隨訪5年，采用來院復(fù)查，電話、微信隨訪及重點(diǎn)病人定期上門隨訪等3種隨訪方式，獲取其疾病情況及生存資料。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 23.0進(jìn)行研究資料分析。觀測(cè)資料中的計(jì)量數(shù)據(jù)（方差不齊同），以±s描述。兩組間的比較為成組t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)，多組間的比較為Kruskal-Wallis秩檢驗(yàn)（檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為Hc）。此外，相關(guān)分析為Spearman相關(guān)性分析。生存等時(shí)間隊(duì)列資料建立Kaplan-Meier生存曲線模型，組間生存率比較為log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，多組間兩兩比較的檢驗(yàn)水準(zhǔn)按Bonferroni校正法調(diào)整為0.017。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織標(biāo)本中miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)由表1可知，結(jié)腸癌組織標(biāo)本中miR-454與V-ATPase mRNA表達(dá)高于良性結(jié)腸病變組織、癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本，miR-132表達(dá)低于良性結(jié)腸病變組織、癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本（P<0.05）。

表1 各組織標(biāo)本中miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)比較/±s

表1 各組織標(biāo)本中miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)比較/±s

注：V-ATPase為液泡膜-ATP酶。①與癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本比較，P<0.017。②與良性結(jié)腸病變組織標(biāo)本比較，P<0.017。

組別結(jié)腸癌組織標(biāo)本良性結(jié)腸病變組織標(biāo)本癌旁正常結(jié)腸組織標(biāo)本Hc值P值例數(shù)96 82 96 miR-454 69.86±7.29①②10.74±2.03①1.28±0.74 30.04<0.001 miR-132 1.46±0.25①②3.68±0.73①4.59±1.24 16.22<0.001 V-ATPase mRNA 5.42±0.41①②2.79±0.38①1.96±0.32 44.66<0.001

2.2 miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌病人一般資料、臨床病理參數(shù)的關(guān)系由表2可知，不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤長(zhǎng)徑病人miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中低分化、Ducks分期C~D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌病人miR-454、V-ATPase mRNA表達(dá)高于高分化、Ducks分期為A~B期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人，miR-132表達(dá)低于高分化、Ducks分期為A~B期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人（P<0.05）。

表2 miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與96例結(jié)腸癌病人一般資料、臨床病理參數(shù)的關(guān)系/±s

表2 miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與96例結(jié)腸癌病人一般資料、臨床病理參數(shù)的關(guān)系/±s

注：V-ATPase為液泡膜-ATP酶。

項(xiàng)目年齡≥60歲<60歲性別男 女腫瘤部位左半結(jié)腸右半結(jié)腸腫瘤長(zhǎng)徑>3 cm≤3 cm組織分化程度中低分化高分化Ducks分期C~D期A~B期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無例數(shù)55 41 47 49 54 42 50 46 55 41 59 37 49 47 miR-454 70.15±7.62 68.40±6.75 68.86±7.39 70.82±7.18 70.58±6.34 68.93±8.02 71.05±6.94 68.57±8.16 78.56±7.85 58.19±5.93 80.14±9.02 53.47±6.73 81.25±9.26 57.99±6.49 t值1.17 1.32 1.13 1.61 13.91 15.75 14.30 P值0.246 0.191 0.263 0.111<0.001<0.001<0.001 miR-132 1.47±0.22 1.51±0.29 1.49±0.21 1.43±0.27 1.44±0.29 1.49±0.24 1.42±0.23 1.50±0.30 1.30±0.19 2.04±0.36 0.92±0.16 2.32±0.31 0.86±0.14 2.09±0.35 t值0.77 1.21 0.90 1.47 11.98 25.43 22.43 P值0.444 0.229 0.369 0.144<0.001<0.001<0.001 V-ATPase mRNA 5.44±0.36 5.39±0.47 5.46±0.41 5.38±0.50 5.47±0.34 5.36±0.48 5.49±0.32 5.34±0.52 5.97±0.54 4.68±0.35 6.18±0.59 4.21±0.28 6.39±0.57 4.41±0.32 t值0.59 0.86 1.31 1.72 14.17 22.00 21.10 P值0.556 0.395 0.192 0.089<0.001<0.001<0.001

2.3 各指標(biāo)表達(dá)與結(jié)腸癌組織分化程度、Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系由表3可知，Spearman相關(guān)性分析顯示，miR-454、V-ATPase mRNA表達(dá)與組織分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)，與Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，miR-132表達(dá)與組織分化程度呈顯著正相關(guān)，與Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

表3 miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與96例結(jié)腸癌組織分化程度、Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（r值，P值）

2.4 miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌病人生存率關(guān)系由表4可知，以結(jié)腸癌病人miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA平均數(shù)為界限，將病人分為miR-454低表達(dá)（<69.86）、高表達(dá)（≥69.86）、miR-132低表達(dá)（<1.46）、高表達(dá)（≥1.46）、VATPase mRNA（<5.42）、高表達(dá)（≥5.42）病人，采用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行分析，顯示miR-454、VATPase高表達(dá)病人3年、5年生存率低于低表達(dá)病人（P<0.05），miR-132高表達(dá)病人3年、5年生存率高于低表達(dá)病人（P<0.05）。

表4 miR-454、miR-132、V-ATPase mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌病人生存率關(guān)系/例（%）

3 討論

在結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，致癌基因激活、抑癌基因失活起著重要的作用［7-8］。雖然現(xiàn)已闡明結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程機(jī)制，相應(yīng)診療也已得到有效改善，但仍有50%結(jié)腸癌病人術(shù)后發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，威脅生命安全［9-10］。因此，研究新的轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)標(biāo)志物，探索參與結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制是當(dāng)前亟待解決問題之一。

miR-132在癌細(xì)胞中通過對(duì)致癌基因或抑癌基因的作用，可參與癌癥發(fā)生、發(fā)展［11］。本研究結(jié)果顯示，miR-132在結(jié)腸癌組織標(biāo)本中呈低表達(dá)趨勢(shì)。國(guó)外研究認(rèn)為，miR-132表達(dá)量增加，可直接靶向結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子、TALIN2蛋白，促進(jìn)癌細(xì)胞脫落凋亡，改善細(xì)胞黏附，顯著抑制癌細(xì)胞集落形成［12］。另外，對(duì)比不同臨床病理特征病人miR-132表達(dá)發(fā)現(xiàn)，中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌病人miR-132表達(dá)低于高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人，原因可能在于miR-132通過下調(diào)GTP酶激活蛋白結(jié)合蛋白（G3BP）1/G3BP2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制，降低腫瘤轉(zhuǎn)移能力，阻礙腫瘤分化、遷移［13］。趙繼明、彭健［14］通過體外平板克隆形成實(shí)驗(yàn)也顯示，miR-132高表達(dá)促使結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞克隆形成率從21%降至7%，降低細(xì)胞遷移能力，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO增殖，有力佐證了miR-132具有作為特異性抑制腫瘤轉(zhuǎn)移靶標(biāo)的潛力，可為抑制結(jié)腸癌腫瘤轉(zhuǎn)移提供新靶點(diǎn)。

miR-454作為miRNA在體液中的存在形式，對(duì)癌細(xì)胞增殖具有重要促進(jìn)作用。王勇等［15］通過對(duì)直腸癌中miR-454表達(dá)進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，miR-454在正常直腸組織、癌旁組織及癌組織中呈遞增式表達(dá)，支持本研究觀點(diǎn)，充分說明miR-454過高表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)育生長(zhǎng)。另外，miR-454基因不僅對(duì)CYLD基因表達(dá)水平具有負(fù)調(diào)控作用，還能通過上調(diào)原癌基因c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1基因表達(dá)，提高結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力［16］。Spearman相關(guān)性分析可知，miR-454表達(dá)與組織分化程度存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著正相關(guān)關(guān)系，充分證實(shí)了miR-454在結(jié)腸癌疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性推動(dòng)作用。

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移可能在于腫瘤細(xì)胞破壞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），造成細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與ECM間信號(hào)傳遞出現(xiàn)異常。分析V-ATPase mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌病人臨床病理參數(shù)相關(guān)性，結(jié)腸癌組織中VATPase呈高表達(dá)，與趙加應(yīng)等［17］報(bào)道相符，且VATPase高表達(dá)與組織分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)性，與Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，提示VATPase mRNA表達(dá)上調(diào)可作為結(jié)腸癌新的標(biāo)志基因促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，進(jìn)而參與其惡性轉(zhuǎn)化。V-ATPase高表達(dá)能分泌、激活腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2，降低ECM，另外酸性微環(huán)境一定程度能促進(jìn)組織蛋白酶B/D、纖溶酶原網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)激活，增加MMP、纖溶酶含量，重構(gòu)ECM，加重腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移［18-20］。進(jìn)一步采用Kaplan-Meier生存曲線分析可知，V-ATPase高表達(dá)可增加結(jié)腸癌病人死亡風(fēng)險(xiǎn)，可作為遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。

綜上可知，miR-454、V-ATPase mRNA表達(dá)與組織分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)，與Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，miR-132表達(dá)與組織分化程度呈顯著正相關(guān)，與Ducks分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著負(fù)相關(guān)，可為結(jié)腸癌惡性化生物學(xué)行為特征、病理級(jí)別、預(yù)后判斷提供客觀依據(jù)。