2型糖尿病病人外周血同源性磷酸酶-張力蛋白誘導(dǎo)的激酶1、Parkin蛋白、視神經(jīng)蛋白表達(dá)與腎損傷程度的關(guān)系研究

張文博，郭宇，袁園，胡建龍，張穎裕

作者單位：河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 洛陽 471000

糖尿病腎病（DN）是2型糖尿病（T2DM）常見并發(fā)癥，在T2DM人群中患病率達(dá)30%~50%，其發(fā)生可嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，增加病死率，早期發(fā)現(xiàn)病人腎損害是改善預(yù)后關(guān)鍵［1-3］。但臨床上常規(guī)檢測無法滿足DN早期診斷需求，如早期常規(guī)尿蛋白檢測存在敏感度不足弊端，尿微量白蛋白（mAlb）檢測特異性不足，且其檢測水平容易受距離運動、尿路感染、蛋白攝入過多等因素影響［4］。近些年來，有不少研究認(rèn)為，可能存在一些比mAlb診斷DN更為敏感、準(zhǔn)確的早期實驗室指標(biāo)，從DN發(fā)病相關(guān)機制角度去尋找敏感生物標(biāo)志物是重要研究方向［5］。有研究指出，線粒體自噬異常可通過影響線粒體氧化應(yīng)激及動力學(xué)等過程，參與腎小管細(xì)胞凋亡及損傷，與DN發(fā)病關(guān)聯(lián)密切，檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白或許可為DN早發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)［6］。同源性磷酸酶-張力蛋白誘導(dǎo)的激酶1（，PINK1）/Parkin蛋白途徑介導(dǎo)的線粒體自噬是典型模式，PINK1、Parkin蛋白表達(dá)下調(diào)時，線粒體自噬水平下降，可使得線粒體活性氧增加，加重細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［7］。視神經(jīng)蛋白（OPTN）是一種典型自噬受體蛋白，當(dāng)前突變或表達(dá)上調(diào)時，可介導(dǎo)線粒體自噬，有研究認(rèn)為，OPTN是調(diào)控高糖引起線粒體自噬體障礙的關(guān)鍵蛋白［8］。但當(dāng)前關(guān)于PINK1、Parkin蛋白、OPTN表達(dá)與糖尿病腎損傷相關(guān)研究并不多見。本研究通過分析T2DM病人外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN基因表達(dá)水平及與腎損傷程度關(guān)系，旨在為臨床DN早期診斷及病情評估提供新的思路，進(jìn)而指導(dǎo)臨床早期干預(yù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年5月至2021年5月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的156例T2DM病人，收集受試者相關(guān)資料，主要包括性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》［9］中T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)；伴或不伴腎功能損害；年齡范圍40~80歲；性別不限；糖尿病病程1年以上；入組前除降糖治療外，無其他特殊治療；自愿接受相關(guān)檢查且簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并酮癥酸中毒、高滲性昏迷等急性并發(fā)癥；合并惡性腫瘤、心腦血管疾病、肝臟疾病、自身免疫性疾病、傳染性疾病等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病；合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神障礙；合并發(fā)熱、尿路感染等影響尿蛋白測定因素；妊娠期或哺乳期女性；近期腎毒性藥物應(yīng)用史；既往慢性腎臟病史。156例T2DM病人根據(jù)是否合并DN，分為非DN組92例、DN組64例，其中DN組病人根據(jù)尿微量白蛋白/肌酐比值（UACR）水平，分為早期DN組（EDN組，UACR 30~299 mg/g）38例、臨床期DN組（CDN組，UACR≥300 mg/g）26例，診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)參考《糖尿病腎病防治專家共識（2014年版）》［10］。另按性別、年齡（±2歲）匹配同期60例于本院體檢中心接受健康體檢人群為健康組，健康體檢者均排除糖尿病及腎臟疾病。

1.2 方法

1.2.1 血生化指標(biāo)檢測 所有受試者入組后均采集空腹肘靜脈血標(biāo)本3 mL送檢驗科，采用全自動生化分析儀（羅氏C8000型）檢測糖代謝指標(biāo)空腹血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c）、脂代謝指標(biāo)總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及腎功能指標(biāo)［血尿素氮、血肌酐水平，計算預(yù)估腎小球濾過率（eGFR）］。

1.2.2 尿液檢測 收集受試者晨起中段尿5 mL送檢驗科，采用免疫比濁法檢測尿微量白蛋白水平，Benedict-Behre肌酐比色法檢測尿肌酐水平，計算UACR。收集受試者24 h尿液，采用雙縮脲法檢測24 h尿蛋白排泄率（UAER）。

1.2.3 外周血PINK1、Parkin、OPTN檢測 采集受試者空腹肘靜脈血5 mL，采用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，應(yīng)用Trizol試劑盒（Invitrogen公司）提取總RNA（純度A260/A280比值在1.8~2.0）；制備互補DNA（cDNA），逆轉(zhuǎn)錄體系共20μL，包括RNA模板2μL、5×RT Buffer 4μL、RNA Ace 0.5μL、RNase Inhibitor 0.5μL、DNTPs 2μL、Oligo（dT）1μL，補充1‰DEPC水至20μL，反應(yīng)條件：42℃溫育10 min，30℃溫育20 min，99℃加熱5 min，4℃冷卻5 min。PINK1正向引物序列CCATC?CATCTAAGTTCTA，反向引物序列AAGAGTATAGT?GACAAGTA；Parkin正 向 引 物 序 列AGAACTGT?GACCTGGAAC，反向引物序列GGCATTTGTTTCGT?GACT；OPTN正向引物序列TGCCTGACATAGACAC?GTTAC，反向引物序列CGGCCTGTTTTCTTTCTTT。采用熒光定量PCR法擴(kuò)增目的基因，PCR反應(yīng)體系共20μL，包括cDNA 2μL、正向引物/反向引物各0.5μL、2×Mix Taq 10μL、DEPC水7μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，（94℃變性30 s，57℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)35次），72℃終延伸10 min；以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法定量分析目的基因相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件，符合正態(tài)分布計量資料以±s描述，多組間比較行方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法；采用多因素logistic回歸分析探究影響因素；繪制受試者操作特征曲線（ROC曲線）分析診斷價值；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組一般資料比較四組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、降糖方案比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；但CDN組、EDN組、非DN組糖尿病病程比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 四組一般資料比較

2.2 四組糖脂代謝指標(biāo)比較四組空腹血糖、HbA1c、三酰甘油、LDL-C比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中空腹血糖、HbA1c均表現(xiàn)為CDN組>EDN組>非DN組>健康組（P<0.05），三酰甘油表現(xiàn)為CDN組、EDN組、非DN組較健康組升高（P<0.05），LDL-C表現(xiàn)為CDN組較健康組升高（P<0.05）。見表2。

表2 四組糖脂代謝指標(biāo)比較/±s

表2 四組糖脂代謝指標(biāo)比較/±s

注：HbA1c為糖化血紅蛋白，LDL-C為低密度膽固醇脂蛋白，HDL-C為高密度膽固醇脂蛋白。①與健康組比，P<0.05。②與非DN組比，P<0.05。③與EDN組比，P<0.05。

組別健康組CDN組EDN組非DN組F值P值空腹血糖/（mmol/L）4.94±0.92 9.42±2.18①②9.26±2.75①②8.65±2.44①50.41<0.001 HbA1c/%5.09±0.47 9.98±1.04①②③8.97±1.35①②8.16±1.52①138.87<0.001總膽固醇/（mmol/L）4.84±0.82 5.12±0.95 5.08±1.06 5.13±1.37 0.87 0.459三酰甘油/（mmol/L）1.64±0.47 2.28±0.46①2.15±0.52①2.11±0.62①13.14<0.001 LDL-C/（mmol/L）3.34±0.58 3.75±0.47①3.61±0.50 3.54±0.66 3.49 0.017 HDL-C/（mmol/L）1.24±0.43 1.05±0.42 1.12±0.44 1.19±0.51 1.22 0.304

2.3 四組腎功能指標(biāo)比較四組血尿素氮、血肌酐、eGFR、UACR、UAER比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中血尿素氮表現(xiàn)為CDN組較EDN組、非DN組、健康組升高（P<0.05），血肌酐表現(xiàn)為CDN組較健康組升高（P<0.05），eGFR表現(xiàn)為CDN組較EDN組、非DN組、健康組下降（P<0.05），UACR、UAER均表現(xiàn)為CDN組>EDN組>非DN組（P<0.05）。見表3。

表3 四組腎功能指標(biāo)比較/±s

表3 四組腎功能指標(biāo)比較/±s

注：eGFR為預(yù)估腎小球濾過率，UACR為尿微量白蛋白/肌酐比值，UAER為24 h尿蛋白排泄率。①與健康組比，P<0.05。②與非DN組比，P<0.05。③與EDN組比，P<0.05。

組別健康組CDN組EDN組非DN組F值P值尿素氮/（mmol/L）4.85±1.88 8.92±2.95①②③5.76±2.84 5.41±1.75 22.58<0.001血肌酐/（mmol/L）67.95±18.24 82.86±22.48①74.15±16.72 70.28±19.55 4.10 0.007 eGFR/［mL·min-1·（1.73 m2）-1］122.42±18.18 84.98±12.84①②③114.95±19.71 118.86±22.24 23.93<0.001 UACR/（mg/g）518.92±279.46②③68.82±21.94②19.97±8.76 199.40<0.001 UAER/（mg/24 h）606.69±304.82②③382.97±141.73②186.82±67.58 85.30<0.001

2.4 四組外周血PINK1、Parkin、OPTN表達(dá)比較四組外周血PINK1、Parkin、OPTN mRNA表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且PINK1、Par?kin、OPTN表達(dá)量均表現(xiàn)為CDN組

表4 四組外周血PINK1、Parkin、OPTN表達(dá)比較/±s

表4 四組外周血PINK1、Parkin、OPTN表達(dá)比較/±s

注：PINK1為同源性磷酸酶-張力蛋白誘導(dǎo)的激酶1，OPTN為視神經(jīng)蛋白。①與健康組比，P<0.05。②與非DN組比，P<0.05。③與EDN組比，P<0.05。

組別健康組CDN組EDN組非DN組F值P值PINK1 mRNA 0.73±0.34 0.31±0.17①②③0.44±0.20①②0.69±0.35 17.13<0.001 Parkin mRNA 0.98±0.35 0.51±0.12①②③0.62±0.18①②0.79±0.28①23.42<0.001 OPTN mRNA 0.18±0.07 0.05±0.01①②③0.10±0.03①②0.14±0.05①45.74<0.001

2.5 外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN與糖脂代謝、腎功能指標(biāo)相關(guān)性Pearson相關(guān)分析法顯示，T2DM病人外周血PINK1、Parkin蛋白表達(dá)量均與空腹血糖、HbA1c、血尿素氮、血肌酐、UACR、UAER呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與eGFR呈正相關(guān)（P<0.05）；OPTN與血尿素氮、血肌酐、UACR、UAER呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與eGFR呈正相關(guān)（P<0.05）。見表5。

表5 外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN與糖脂代謝、腎功能指標(biāo)相關(guān)性

2.6 DN影響因素的多因素logistic回歸分析以是否診斷為DN因變量，將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)差異因素納入多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病病程、HbA1c、UACR、UAER是DN的獨立危險因素（P<0.05），PINK1、Parkin蛋白、OPTN為其保護(hù)因素（P<0.05）。見表6。

表6 糖尿病腎病（DN）影響因素的多因素logistic回歸分析

2.7 外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN對DN的診斷價值以診斷DN為狀態(tài)變量，以外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN mRNA表達(dá)量為檢驗變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN mRNA表達(dá)量診斷DN的ROC曲線下面積分別為0.709、0.754、0.839。見表7。

表7 外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN對DN診斷效能

3 討論

糖尿病引起腎損害可涉及遺傳因素、血流動力學(xué)異常、代謝因素、氧化應(yīng)激作用、免疫炎癥因素等多種機制，其中因高糖導(dǎo)致的糖基化終末代謝產(chǎn)物形成、蛋白激酶C途徑激活、氧化應(yīng)激損傷等過程被認(rèn)為是糖尿病腎損害發(fā)生關(guān)鍵［11-13］。線粒體自噬指通過自噬體形成對多余或功能受損線粒體選擇性清除的過程，其對于維持活性氧平衡、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中十分關(guān)鍵，可參與多種病理生理過程，而新近研究指出，線粒體自噬異常可能通過參與腎小管損傷，在DN發(fā)生發(fā)展中占重要地位［14］，故探究與線粒體自噬相關(guān)標(biāo)志物也是當(dāng)前臨床評估DN發(fā)生發(fā)展的一個重要方向。

PINK1是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，其表達(dá)異常時可引起線粒體結(jié)構(gòu)及功能紊亂，在多種疾病發(fā)病中具有始動作用［15］。Parkin蛋白是一種E3泛素連接酶，其聚集到線粒體外模上后活性增強，可引起包括線粒體融合蛋白1、2在內(nèi)的多種外膜蛋白泛素化，而被泛素化外膜蛋白可為受體蛋白P62、胞質(zhì)自噬分子標(biāo)志物識別并形成自噬小體［16］。研究指出，當(dāng)PINK1在線粒體外膜累積后，可作為一個信號標(biāo)記受損線粒體，“招募”胞質(zhì)Parkin蛋白使之于外膜上累積，二者相互作用可誘導(dǎo)線粒體自噬過程，PINK1/Parkin蛋白途徑也被認(rèn)為是線粒體自噬機制經(jīng)典模式［17］。當(dāng)PINK1、Parkin蛋白表達(dá)缺陷或降低時可導(dǎo)致線粒體自噬障礙，使得線粒體活性氧增加、動力學(xué)異常，激活內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)［18］。有文獻(xiàn)顯示，在糖尿病早期，線粒體自噬可由糖驅(qū)動，機體通過活化線粒體自噬過程來清除受損線粒體，但這一過程隨著病情進(jìn)展被抑制，使得受損線粒體累積、活性氧生成增加，并通過介導(dǎo)細(xì)胞損傷、凋亡過程引起腎小管、心肌損傷，從而參與DN、糖尿病心肌病等并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展［19］。本研究結(jié)果顯示，PINK1、Parkin蛋白表達(dá)量均表現(xiàn)為CDN組

OPTN是一種含577個氨基酸殘基的胞質(zhì)自噬接頭蛋白，可促進(jìn)自噬激活并介導(dǎo)相關(guān)底物進(jìn)入溶酶體降解，進(jìn)而參與蛋白質(zhì)運輸、核因子-кB信號通路、抗病原微生物等過程［22-23］。線粒體受損時，OPTN可通過促進(jìn)自噬體對泛素化線粒體的識別提高線粒體自噬效率，敲除OPTN表達(dá)將直接導(dǎo)致線粒體自噬受阻，繼而引起線粒體堆積、細(xì)胞死亡［24］。文獻(xiàn)顯示，OPTN表達(dá)與青光眼、神經(jīng)退行性病變、腫瘤發(fā)生等相關(guān)［25］。近年來有研究表明，線粒體自噬障礙是高糖誘導(dǎo)的DN腎小管細(xì)胞應(yīng)激性衰老的關(guān)鍵原因，通過高糖誘導(dǎo)可引起腎小管細(xì)胞PINK1、OPTN等mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，導(dǎo)致線粒體自噬障礙，而過表達(dá)OPTN能提高高糖誘導(dǎo)的線粒體自噬體，且OPTN表達(dá)評分與SCr成反比、與eGFR成正比，提示OPTN介導(dǎo)的線粒體自噬與DN進(jìn)展相關(guān)［26］。本研究結(jié)果顯示，OPTN表達(dá)量表現(xiàn)為CDN組

綜上所述，T2DM病人外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN表達(dá)量均下調(diào)，并隨著DN病情進(jìn)展表達(dá)量均進(jìn)一步降低，與病人糖脂代謝及腎損傷表現(xiàn)出相關(guān)性，且檢測PINK1、Parkin蛋白、OPTN表達(dá)量對DN有一定診斷價值，在DN臨床防治中展現(xiàn)出一定應(yīng)用前景，值得深入探究。