微小RNA-520a-5p通過靶向調控鼠雙微體基因影響膠質瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲

張坤虎，陳勃勃，王保江，李虎，楊帆，高良，唐宗椿

作者單位：寶雞高新醫院神經外科，陜西 寶雞 721004

膠質瘤起源于神經間質細胞和神經實質細胞，是腦腫瘤中常見的惡性腫瘤。由于膠質瘤呈侵襲性生長，手術治療難以根治，病人術后易復發，病死率極高［1］。目前，膠質瘤發病的病因尚不明確。微小RNA（miRNA）作為小分子單鏈非編碼RNA在細胞增殖、凋亡和遷移等生命活動中發揮重要功能，能夠作為腫瘤治療的分子靶點［2-5］。在非小細胞肺癌、結腸癌等miR-520a-5p中表達降低，過表達miR-520a-5p可明顯減弱腫瘤細胞的增殖、遷移等惡性行為［6-8］。易偉峰［9］利用MiRNA芯片技術發現膠質瘤組織中miR-520a表達下調，但miR-520a在膠質瘤細胞發生發展中的作用和分子機制還未知。本研究首先檢測了膠質瘤組織中miR-520a-5p的表達水平，并以膠質瘤細胞U251為研究對象，探究了過表達miR-520a-5p對U251細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用及相應機制。

1 材料與方法

1.1 材料選取2016年5月至2018年11月在寶雞高新人民醫院治療的膠質瘤病人腫瘤組織56例，其中男31例，女25例，年齡（48.39±5.81）歲，范圍36~71歲。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。所有病人術前未進行放療、化療等治療，經病理學檢查確診。病理分級，其中Ⅰ級膠質瘤8例，Ⅱ級26例，Ⅲ級22例。另選取56例同時期因顱腦外傷顱內減壓術病人的正常腦組織作為對照，其中男38例，女18例，年齡（45.28±6.93）歲，范圍34~65歲。

1.2 主要材料、試劑和儀器胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；膠質瘤U251細胞，武漢博士德生物工程有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒、RPMI 1640培養基、BCA蛋白試劑盒，英國Abcam；四氮唑藍（MTT），上海譜振生物有限公司；Trizol試劑，美國英杰生命技術有限公司；細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、P21和鼠雙微體基因（MDM2）抗體，美國Santa Cruz公司；B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bax）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體，美國Abcam公司；miR-520a-5p模擬物（mimics）、模擬對照序列（miR-NC）、miR-520a-5p抑制劑（anti-miR-520a-5p）、抑制劑對照序列（anti-miR-NC）、MDM2過表達載體（pcD?NA3.1-MDM2）及空載體（pcDNA3.1）、引物序列，南京金斯瑞生物科技有限公司；逆轉錄及PCR試劑盒，日本TAKARA公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，艾美捷科技有限公司；雙螢光素酶活性檢測試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司。PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；NanoDrop-2000c超微量風光光度計，美國Thermo公司；酶標儀和凝膠成像系統，美國Bio-rad公司；FACSCantoⅡ流式細胞儀美國BD公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測miR-520a-5p表達水平 在液氮保護下充分研磨膠質瘤組織及正常腦組織。Trizol試劑提取組總RNA，逆轉錄后進行PCR擴增。引物序列：miR-520a-5p正向引物5'-CGTAGGATC?GATGCTAGCAAGT-3'，反 向 引 物5'-GCGTTGT?GAATGGCGTGCG-3'；U6正向引物5'-GTCAAGTC?GATAGCTAG-3'，反向引物5'-CGTAAATGCCTG?CAACG-3'。2-??Ct法計算miR-520a-5p表達水平。

1.3.2 細胞培養與分組 將U251細胞培養至10%FBS的RPMI 1640培養基，當融合度達80%時，胰蛋白酶消化。細胞接種于24孔板中（2.5×105個/孔），待細胞融合至60%時，采用LipofectamineTM2000脂質體法，分別將miR-NC（miR-NC組）、miR-520a-5p mimics（miR-520a-5p組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC組）、anti-miR-520a-5p（anti-miR-520a-5p組）、miR-520a-5p mimics與pcDNA3.1-MDM2（miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2組）、miR-520a-5pmimics與pcD?NA3.1（miR-520a-5p+pcDNA3.1組）轉染至U251細胞，轉染時間6 h。

1.3.3 MTT檢測細胞增殖 各組細胞培養24 h、48 h、72 h后，加20μL濃度為5 g/L的MTT。孵育4 h棄上清，加150μL二甲基亞砜，于490 nm處上機檢測吸光度（A）值。存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 培養24 h后收集各組細胞，依據凋亡檢測試劑盒操作步驟檢測細胞凋亡。

1.3.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 收集各組細胞。遷移實驗：向小室上室加細胞懸液100μL（2.5×104個細胞），下室加含10% FBS的培養基500 μL；培養24 h后，固定，結晶紫染色，顯微鏡觀察并計數。侵襲實驗：上室預鋪Matrigel，晾干后加入細胞懸液，其余操作同遷移實驗。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測蛋白表達RIPA試劑提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（25μg蛋白/泳道），以cy?clin D1（1∶2 000）、P21（1∶1 000）、Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶800）、MMP-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）、MDM2（1∶2 000）和GAPDH（1∶1 000）為一抗，辣根過氧化酶標記的山羊抗兔為二抗（1∶5 000）。以GAPDH為內參，Quantity One軟件計算目的蛋白相對表達水平。

1.3.7 雙螢光素酶報告基因實驗 經PCR反應擴增包含miR-520a-5p結合位點的MDM2的3’UTR，插入至PGL3質粒下游，命名為WT-MDM2。利用基因突變技術將結合位點突變后，插PGL3質粒下游，命名為MUT-MDM2。向U251細胞分別共轉染WTMDM2、MUT-MDM2與miR-520a-5p mimics或miRNC，轉染6 h后檢測螢光素酶活性。

1.4 統計學方法SPSS 22.0軟件分析本研究數據。計量資料±s表示，獨立樣本t檢驗分析兩組間數據，單因素方差分析分析多組間數據，總體有差異進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在正常腦組織和膠質瘤組織中miR-520a-5p的表達miR-520a-5p水平：正常腦組織0.75±0.07，Ⅰ級膠質瘤組織0.54±0.04，Ⅱ級膠質瘤組織0.14±0.02，Ⅲ級膠質瘤組織0.05±0.01，以上miR-520a-5p水平比較，t=64.56，P<0.001；且膠質瘤組織中miR-520a-5p表達較正常腦組織低（P<0.05）。

2.2 過表達miR-520a-5p影響U251細胞增殖、凋亡miR-520a-5p組miR-520a-5p水平、細胞凋亡率較miR-NC組高（P<0.05），細胞存活率、cyclin D1和Bcl-2水平較miR-NC組低（P<0.05），而P21和Bax水平較miR-NC組高（P<0.05）。見圖1，表1。

圖1 過表達miR-520a-5p對U251細胞凋亡及增殖、凋亡相關蛋白表達的影響：A為過表達miR-520a-5p對U251細胞凋亡的影響；B為過表達miR-520a-5p對U251細胞增殖和凋亡相關蛋白cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2表達的影響

表1 過表達miR-520a-5p對細胞U251增殖、凋亡的影響/±s

表1 過表達miR-520a-5p對細胞U251增殖、凋亡的影響/±s

注：miR-520a-5p為miR-520a-5p模擬物，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為P21蛋白，Bax為B淋巴細胞瘤-2相關蛋白，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

組別miR-NC miR-520a-5p t值P值重復次數33 miR-520a-5p 0.14±0.01 0.58±0.06 17.72<0.001 cyclin D1蛋白0.72±0.07 0.16±0.02 18.84<0.001 P21蛋白0.25±0.02 0.90±0.09 17.27<0.001 Bax蛋白0.28±0.03 0.81±0.08 15.20<0.001 Bcl-2蛋白1.06±0.10 0.32±0.03 17.36<0.001凋亡率/%7.82±0.77 21.17±2.06 14.87<0.001細胞活性（OD 490 nm）24 h 0.50±0.05 0.46±0.04 5.36<0.001 48 h 0.95±0.09 0.49±0.05 10.94<0.001 72 h 1.36±0.13 0.71±0.07 10.78<0.001

2.3 過表達miR-520a-5p對U251細胞遷移、侵襲的影響miR-520a-5p組遷移和侵襲細胞數較miRNC組低（P<0.05），MMP-2的水平較miR-NC組低（P<0.05），而E-cadherin水平較miR-NC組高（P<0.05）。見圖2，3；表2。

表2 過表達miR-520a-5p對細胞U251遷移、侵襲及相關蛋白的影響/±s

表2 過表達miR-520a-5p對細胞U251遷移、侵襲及相關蛋白的影響/±s

注：E-cadherin為E-鈣黏蛋白，MMP-2為基質金屬蛋白酶2。

組別miR-NC miR-520a-5p t值P值重復次數33 E-cad?herin 0.12±0.01 0.58±0.05 22.10<0.001 MMP-2 0.91±0.09 0.35±0.03 14.46<0.001遷移細胞數144±13.38 67±6.26 12.77<0.001侵襲細胞數135±13.12 59±5.47 13.10<0.001

圖2 腦膠質瘤組織中過表達miR-520a-5p對U251細胞遷移、侵襲數的影響（結晶紫染色×200）

2.4 miR-520a-5p靶向調控MDM2的表達MDM2的3’UTR與miR-520a-5p的互補序 列 見 圖4A。miR-520a-5p mimics與WT-MDM2共轉染至U251細胞后，螢光素酶活性明顯降低（P<0.05），而miR-520a-5p mimics與MUT-MDM2共轉染至U251細胞后，螢光素酶活性無顯著變化（P>0.05），見表3。

表3 雙螢光素酶報告實驗結果/±s

表3 雙螢光素酶報告實驗結果/±s

注：WT-MDM2為野生型MDM2基因，MUT-MDM2為突變型MDM2基因。

組別miR-NC miR-520a-5p t值P值重復次數33 WT-MDM2 1.01±0.09 0.20±0.02 21.52<0.001 MUT-MDM2 0.99±0.09 0.94±0.09 0.97 0.359

miR-NC組、miR-520a-5p組、anti-miR-NC組、an?ti-miR-520a-5p組MDM2的蛋白水平分別為0.50±0.05、0.12±0.01、0.51±0.05、0.92±0.09。與miR-NC組比較，miR-520a-5p組MDM2的蛋白水平顯著降低（P<0.05）；而與anti-miR-NC組比較，anti-miR-520a-5p組MDM2的蛋白水平顯著升高（P<0.05），見圖4B。這表明miR-520a-5p靶向負調控MDM2表達。

圖4 miR-520a-5p靶向調控MDM2表達：A為MDM2的3’UTR與miR-520a-5p互補的核苷酸序列；B為miR-520a-5p對MDM2蛋白表達的影響

2.5 過表達MDM2降低了miR-520a-5p對U251細胞增殖、凋亡作用miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2組存活率、cyclin D1和Bcl-2水平較miR-520a-5p+pcDNA3.1組高（P<0.05），凋亡率、P21和Bax水平較miR-520a-5p+pcDNA3.1組低（P<0.05）。見圖5，表4。

表4 過表達MDM2逆轉miR-520a-5p對細胞U251增殖和凋亡的作用/±s

表4 過表達MDM2逆轉miR-520a-5p對細胞U251增殖和凋亡的作用/±s

注：MDM2為鼠雙微體基因，Bax為B淋巴細胞瘤-2相關蛋白，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為P21蛋白。①與miR-NC組比較，P<0.05。②與miR-520a-5p+pcDNA3.1組比較，P<0.05。

組別miR-NC miR-520a-5p miR-520a-5p+pcDNA3.1 miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2 F值P值重復次數3 3 3 3 MDM2蛋白0.50±0.05 0.11±0.01①0.11±0.01 0.34±0.03②242.00<0.001 Bax蛋白0.28±0.03 0.81±0.08①0.80±0.08 0.53±0.05②94.47<0.001 Bcl-2蛋白1.06±0.10 0.32±0.03①0.31±0.03 0.68±0.07②182.17<0.001凋亡率/%7.82±0.77 21.17±2.06①21.15±2.06 12.36±1.21②100.80<0.001 CyclinD1蛋白0.72±0.07 0.16±0.02①0.15±0.02 0.41±0.04②236.93<0.001 P21蛋白0.25±0.02 0.90±0.09①0.90±0.09 0.53±0.05②125.36<0.001細胞活性（OD 490 nm）24 h 0.50±0.05 0.46±0.04①0.34±0.03 0.45±0.04②20.70<0.001 48 h 0.95±0.09 0.49±0.05①0.47±0.05 0.68±0.07②66.17<0.001 72 h 1.36±0.13 0.71±0.07①0.70±0.07 0.96±0.09②66.00<0.001

圖5 過表達MDM2降低了miR-520a-5p對U251增殖凋亡相關蛋白表達的影響：A為同時過表達miR-520a-5p和MDM2對U251細胞凋亡的影響；B為同時過表達miR-520a-5p和MDM2對U251細胞中cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

2.6 過表達MDM2降低了miR-520a-5p對U251細胞遷移、侵襲的作用miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2組遷移和侵襲細胞數、MMP-2水平較miR-520a-5p+pcDNA3.1組高（P<0.05），E-cadherin水平較miR-520a-5p+pcDNA3.1組低（P<0.05）。見圖6，7；表5。

表5 過表達MDM2逆轉miR-520a-5p對細胞U251遷移、侵襲及相關蛋白表達的作用/±s

表5 過表達MDM2逆轉miR-520a-5p對細胞U251遷移、侵襲及相關蛋白表達的作用/±s

注：E-cadherin為E-鈣黏蛋白，MMP-2為基質金屬蛋白酶2，MDM2為鼠雙微體基因。①與miR-NC組比較，P<0.05。②與miR-520a-5p+pcDNA3.1組比較，P<0.05。

組別miR-NC miR-520a-5p miR-520a-5p+pcDNA3.1 miR-520a-5p+pcDNA3.1-MDM2 F值P值重復次數3333 E-cadherin 0.12±0.01 0.58±0.05①0.59±0.06 0.30±0.03②176.76<0.001 MMP-2 0.91±0.09 0.35±0.03①0.32±0.03 0.62±0.06②134.76<0.001遷移細胞數144±13.38 67±6.26①65±6.10 102±9.55②95.39<0.001侵襲細胞數135±13.12 59±5.47①57±5.41 95±9.26②102.21<0.001

圖3 過表達miR-520a-5p對U251細胞中MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響

圖6 腦膠質瘤組織中過表達miR-520a-5p及MDM2對U251細胞遷移和侵襲數的影響（結晶紫染色×200）

3 討論

miRNA通過調控靶基因的表達及相關信號通路，發揮類似抑癌基因或癌基因的作用，參與腫瘤的發生、發展及轉歸過程［10-11］。作為一種miRNA，miR-520a-3p與多種腫瘤的發生發展密切相關。研究顯示，過表達miR-520a-3p可減弱非小細胞肺癌（NSCLC）細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時還可促進細胞凋亡，其通過靶向負調控EphA2表達抑制NSCLC發展進程［12］；miR-520a-3p在胃癌組織和細胞中miR-520a-3p表達下調，過表達miR-520a-3p通過靶向抑制SKA2的表達顯著減弱了胃癌細胞SGC-7901和MGC-803的增殖、侵襲和遷移能力，可能是胃癌治療的新靶點［13］；甲狀腺乳頭狀癌（PTC）組織中miR-520a-3p表達下調，促進miR-520a-3p表達通過靶向抑制JAK1下調PTC細胞活力、遷移和侵襲能力，同時促進細胞凋亡，阻滯細胞周期進程［14］。但目前，miR-520a-5p在膠質瘤發生發展中的作用和分子機制還未知。

本研究首先檢測了膠質瘤組織和正常腦組織中miR-520a-5p表達水平，結果顯示，在膠質瘤組織中的表達miR-520a-5p明顯降低，提示miR-520a-5p可能作為抑癌癌基因參與膠質瘤發生和發展。通過轉染miR-520a-5p mimics過表達膠質瘤U251細胞中miR-520a-5p后，細胞OD值、遷移和侵襲數降低，增加凋亡率升高，過表達miR-520a-5p抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，且促進細胞凋亡。cyclin D1是調控細胞周期的重要蛋白，上調cyclin D1表達可促進細胞從G1期進入S期，促進細胞增殖［15］。P21是細胞增殖抑制因子，上調P21表達能夠顯著抑制細胞增殖［16］。Bax、Bcl-2參與細胞凋亡，而Bcl-2表達增加時則與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用［17］。MMP-2作為一種基質金屬蛋白酶，可通過降解細胞外基質發揮促進腫細胞遷移和侵襲的功能［18］。腫瘤細胞經上皮間質轉化過程失去極性而獲得間質特性促進自身遷移，而其E-cad?herin作為上皮標志物表達降低［19］。本研究顯示，過表達miR-520a-5p后可抑制cyclin D1、MMP-2和Bcl-2蛋白表達，增加P21、E-cadherin和Bax蛋白表達，發揮抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡的功能，提示miR-520a-5p可作為膠質瘤治療的分子靶點。

MDM2位于人染色體12q13-14，參與多發性骨髓瘤、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤的發生和發展［20-22］。研究顯示，MDM2蛋白在膠質瘤組織中表達升高，與膠質瘤的病理分級等臨床特征密切相關，可用于膠質瘤病人預后評估的參考指標［23］；敲減circSERPINA3可靶向miR-944/MDM2抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲［24］；miRNA-379-5p通過直接靶向MDM2抑制膀胱癌細胞的生長和遷移［25］；miR-548b-3p可靶向抑制MDM2表達降低乳腺癌細胞的增殖和轉移［26］。為了探討miR-520a-5p影響膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的作用機制，本研究通過證實miR-520a-5p負調控MDM2表達，過表達MDM2降低過表達miR-520a-5p對U251細胞增殖、遷移和遷徙能力的抑制作用及細胞凋亡的促進作用，表明過表達miR-520a-5p通過靶向負調控MDM2抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導其凋亡。

圖7 過表達miR-520a-5p及MDM2對U251細胞中MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響

綜上所述，miR-520a-5p可能通過靶向負調控MDM2表達抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力，并誘導其凋亡。