非洲豬瘟病毒PCR檢測在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的應(yīng)用

劉 敏

（廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北廊坊 065000）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的一類急性、熱性和高度接觸性傳染病，該病毒屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的一種雙股DNA病毒，其至少能夠編碼34種結(jié)構(gòu)蛋白，并且這些蛋白在傳代后發(fā)生變異的概率非常大，給后期的疫苗研制以及疫情防控造成了較大的難度。生豬感染非洲豬瘟后會有較明顯的臨床反應(yīng)，主要表現(xiàn)為體溫明顯升高，皮膚充血嚴(yán)重，患豬出現(xiàn)水腫，臟器出血，妊娠期的母豬還會出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等情況，患病豬的死亡率可高達(dá)100%，被我國列為一類動物疫病，同時(shí)世界動物衛(wèi)生組織（OIE）也將其列為必須上報(bào)的動物性疫病[1]。自1909年該病在肯尼亞被首次報(bào)道后，開始在非洲各國流行，隨后逐漸向世界范圍內(nèi)擴(kuò)散，2018年非洲豬瘟首次在我國發(fā)生，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的打擊。至今為止，非洲豬瘟已經(jīng)在非洲、亞洲以及歐美等多個(gè)國家和地區(qū)流行，由于其高傳播性、高致病性以及高致死率等特點(diǎn)，該病受到了世界各國的高度重視。非洲豬瘟的防控形勢非常嚴(yán)峻，只有在養(yǎng)殖過程中建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確性以及特異性均比較好的檢測方法，才能為更好地預(yù)防該病提供條件。

1 非洲豬瘟的病原特點(diǎn)

非洲豬瘟病毒顆粒的直徑在175～215 nm之間，為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，病毒表面具有囊膜，基因組的大小為170～190 kb，為雙股線狀DNA。該病毒可以通過多種途徑傳播，主要以接觸性傳播為主，可以從感染豬只的血液、臟器以及組織液或其他排泄物中分離出來，患病豬以及隱性帶毒豬為該病的主要傳染源，通常情況下，感染豬只在發(fā)病前的1～2 d即可通過口、鼻、咽喉等進(jìn)行排毒。非洲豬瘟病毒可在無光照且低溫環(huán)境下的血液中存活6年之久，在正常的室溫中可以存活幾周，對高溫較為敏感，在55℃的環(huán)境中經(jīng)過30 min即可被滅活，在60℃的環(huán)境下6 min即可被殺滅。

2 非洲豬瘟的檢疫現(xiàn)狀

當(dāng)前，尚未出現(xiàn)特異性治療非洲豬瘟的方法，各大養(yǎng)殖企業(yè)主要采取各種預(yù)防措施，降低該病的發(fā)生，以減少該病所帶來的損失，防止非洲豬瘟病毒的輸入成了防控的重中之重。其中，動物及其相關(guān)產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫就成為了第一道防線。首先，各國均根據(jù)相應(yīng)的法律法規(guī)對進(jìn)出口產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格的檢驗(yàn)檢疫。其次，各大養(yǎng)殖企業(yè)在引進(jìn)生豬時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格的非洲豬瘟病毒檢驗(yàn)檢疫，包括豬肉、相關(guān)肉制品、凍精液或胚胎卵源等。在生豬養(yǎng)殖過程中，通過對各個(gè)環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒的檢測，做到及時(shí)預(yù)警、及時(shí)防控，從而降低該病毒傳入豬場的概率，對生豬產(chǎn)業(yè)的安全養(yǎng)殖具有非常重要的意義。在檢測非洲豬瘟病毒方面需要建立一種敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測方式來提高整個(gè)檢測過程的效率。當(dāng)前能夠檢測診斷非洲豬瘟病毒的方法較多，包括：動物接種試驗(yàn)、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、免疫電泳試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、直接或間接免疫熒光試驗(yàn)以及間接酶聯(lián)免疫蝕斑試驗(yàn)和PCR試驗(yàn)等，除PCR試驗(yàn)以外的診斷方式對試驗(yàn)室以及操作條件的要求相對較高，并且較為復(fù)雜，耗時(shí)較長，同時(shí)大多會涉及到活病毒的應(yīng)用，具有一定的危險(xiǎn)性。而PCR試驗(yàn)的敏感性以及特異性均比較高，且不會涉及到活病毒的應(yīng)用，適用于疑似病例的診斷檢測，可以用于養(yǎng)殖場內(nèi)大規(guī)模的病例篩查，是當(dāng)下非洲豬瘟診斷較為推崇的一種檢測方式。近年來，隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步又出現(xiàn)了一種新型PCR技術(shù)——實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR），與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)是適用范圍更為廣泛，2種PCR檢測方法的靈敏度及結(jié)果的可靠性均較高。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理

傳統(tǒng)常規(guī)的PCR技術(shù)主要是通過質(zhì)粒DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到其循環(huán)反應(yīng)的終產(chǎn)物，然后對其進(jìn)行定量和定性分析，這種技術(shù)無法對起始的模板進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，因此無法對擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過在PCR的反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，既可以根據(jù)熒光信號的變化來實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程中的每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物準(zhǔn)確的量變，還可以通過將Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對進(jìn)行分析，即對起始模板進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在非洲豬瘟檢測中的應(yīng)用

4.1 樣品的采集

對于活豬可以無菌條件下采集EDTA抗凝血樣品或者采集口、鼻拭子等樣品置于pH值為7.2的PBS緩沖液中保存；對于病死豬則可以在無菌條件下采集肝臟、脾臟和淋巴組織等樣品；對于環(huán)境樣品主要采集病豬活動過的圈舍墻面、地面、飼槽、水槽以及豬場內(nèi)的土壤和污水等；對于運(yùn)輸?shù)能囕v應(yīng)采集車頭、車尾輪胎以及車廂內(nèi)的樣品等[2]；同時(shí)，還應(yīng)對養(yǎng)殖場以及飼料廠在生豬不同生長階段的飼料樣品進(jìn)行采集并進(jìn)行檢測。

4.2 檢測的儀器及試劑

4.2.1 PCR檢測所需儀器

在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)之前應(yīng)準(zhǔn)備好以下儀器：4℃冰箱和-80℃冰箱、可加熱的混勻儀、電子天秤、高壓蒸氣滅菌鍋、耐高壓離心管、一套1～1 000 μL的微量加樣器、帶濾芯的加樣器吸頭、超凈工作臺、生物安全柜、高速臺式冷凍離心機(jī)、超聲波水浴儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、全自動核酸提取儀、電熱恒溫水浴槽、國產(chǎn)普通離心機(jī)等。當(dāng)前生產(chǎn)PCR試驗(yàn)儀器的廠家較多，有多種國產(chǎn)和進(jìn)口的產(chǎn)品可以選擇，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身實(shí)際條件選擇儀器，并明確其生產(chǎn)廠家[2]。

4.2.2 PCR試驗(yàn)的試劑與耗材

在進(jìn)行PCR試驗(yàn)前應(yīng)提前準(zhǔn)備好專用的工作服、工作鞋以及工作帽等，并提前對試驗(yàn)環(huán)境做好紫外線照射消毒，以免造成污染，導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。提前準(zhǔn)備好一次性手套和吸水紙、可移動的紫外燈等。準(zhǔn)備好需要檢測的非洲豬瘟病毒相關(guān)基因的引物、SYB green反應(yīng)體系，如果直接購買非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒操作會更簡單。

4.3 檢測方法

在檢測非洲豬瘟病毒時(shí)，嚴(yán)格按照購買的非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行[3]。

4.4 結(jié)果判定

進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對照組，通過對比Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以發(fā)現(xiàn)陽性對照組的Ct值＜35，并且會有特異性的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，而陰性對照組應(yīng)該無Ct值出現(xiàn)或Ct值≥40；同時(shí)，陰性對照組沒有特異性擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表示試驗(yàn)的結(jié)果是可靠有效的。此時(shí)，若檢測樣品的Ct值＜40，同時(shí)出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增曲線，則可判定為陽性。若被檢測的樣品沒有Ct值或Ct值≥40，則可以判定該樣品為陰性[3]。

4.5 試驗(yàn)結(jié)果及常見的問題分析

現(xiàn)階段，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測等方法在養(yǎng)殖場內(nèi)開展大規(guī)模病原學(xué)檢測的活動較少。由于基層獸醫(yī)缺乏試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)或試驗(yàn)條件有限等因素限制，檢測結(jié)果經(jīng)常會出現(xiàn)試驗(yàn)不成立、易出現(xiàn)假陽性或假陰性，重復(fù)組試驗(yàn)結(jié)果不同等問題。

4.5.1 試驗(yàn)不成立

試驗(yàn)不成立主要表現(xiàn)為2種情況，一是陽性對照組無曲線或者Ct值＞35，這可能與陽性對照樣品的反復(fù)凍融有關(guān)系。二是陰性對照組Ct值＜40，這可能與實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境有關(guān)系，在試驗(yàn)前未進(jìn)行徹底的消毒或在試驗(yàn)過程中的人為操作不規(guī)范造成污染等。

4.5.2 假陽性

檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性可能與檢測區(qū)域設(shè)置不合理、樣品提取人員操作及試劑配制等未在超凈臺或生物安全柜中進(jìn)行，操作方法不規(guī)范或核酸發(fā)生氣溶膠污染、試驗(yàn)結(jié)束后未進(jìn)行徹底消毒等有關(guān)系[4]。

4.5.3 假陰性

檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性的情況主要可分為樣品問題和人為因素等2方面，一是樣品問題，如果在采血過程使用EDTA抗凝血管，則可能會出現(xiàn)肝素抑制PCR的反應(yīng)，而采集的樣品過少則可能使得EDTA全血溶液濃度太大，對試驗(yàn)造成干擾，而出現(xiàn)假陰性。Ct值＞35的檢測樣品在很大程度上會受到環(huán)境、試驗(yàn)操作手法等的影響。此外，樣品保存的時(shí)間也對結(jié)果有較大影響，樣品保存時(shí)間過長則非常容易導(dǎo)致假陰性。二是人為因素，主要是試驗(yàn)員在試驗(yàn)操作過程中的問題，例如少加樣品、漏加樣品重復(fù)檢測以及人工標(biāo)記信號對熒光信號造成干擾等。

4.5.4 重復(fù)檢測結(jié)果不一致

造成重復(fù)檢測結(jié)果不一致的主要原因可能與檢測試劑反復(fù)凍融、樣品前處理時(shí)未離心，或未混勻?qū)е虏《镜姆植疾町悺⒒旌系臉悠妨刻蠹叭苎獦悠分醒t素的含量存在較大差異等有關(guān)。

5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)時(shí)的注意事項(xiàng)

5.1 提高人員操作標(biāo)準(zhǔn)性

進(jìn)行PCR試驗(yàn)操作的人員應(yīng)該熟練掌握PCR的原理、操作方法和步驟，并且按照相關(guān)的操作規(guī)程與標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行試驗(yàn)操作，注重每一步的操作細(xì)節(jié)，如提前做好實(shí)驗(yàn)室的滅菌處理，加樣加液時(shí)小心勻漿，防止產(chǎn)生氣溶膠等，避免由于試驗(yàn)操作不規(guī)范導(dǎo)致試劑樣品污染，造成試驗(yàn)結(jié)果有誤差。

5.2 提高生物安全規(guī)范性

對檢測非洲豬瘟病毒的PCR試驗(yàn)應(yīng)使用認(rèn)證合格的儀器進(jìn)行檢測，不同的設(shè)備與儀器不可混用，在進(jìn)行試驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與生物安全柜等至少要進(jìn)行30 min的紫外照射消毒。試驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)對操作臺及試驗(yàn)用具等使用75%的酒精等化學(xué)制劑消毒，對生物安全柜進(jìn)行10 min以上的通風(fēng)，并對環(huán)境進(jìn)行30 min的紫外照射消毒。試驗(yàn)過程中所使用的試劑、產(chǎn)生的廢料等應(yīng)分別放置到相應(yīng)的回收處，有專人保管，由生物安全公司進(jìn)行統(tǒng)一處理。此外，二級實(shí)驗(yàn)室不具有保存非洲豬瘟病毒的條件，應(yīng)當(dāng)天檢測后對樣品進(jìn)行及時(shí)的高壓滅菌處理[5,6]。

6 小結(jié)

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)的靈敏度較高，并且特異性較強(qiáng)，可以廣泛應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖企業(yè)對非洲豬瘟病毒的排查以及患病豬群的疫情檢測。但應(yīng)注意試驗(yàn)操作的規(guī)范性，避免因?yàn)槿藶椴僮鞑灰?guī)范、試劑儀器及試驗(yàn)環(huán)境等因素對試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。