病理性鈣信號與急性胰腺炎

牛夢亞 文禮

上海市胰腺疾病重點實驗室，上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院消化科，上海 201600

【提要】 胰腺腺泡細胞異常鈣信號是AP最早期的細胞內事件，在AP的發生和發展過程中起關鍵作用。腺泡細胞內鈣信號的轉導受細胞內鈣信號元件嚴格調控，主要包括細胞內鈣庫上表達的鈣釋放通道如三磷酸肌醇受體和蘭尼堿受體、細胞膜上的鈣庫操縱型鈣內流通道以及參與回補胞內鈣庫的肌質網膜鈣ATP酶和參與鈣外排的胞膜鈣ATP酶等。目前研究提示這些鈣信號元件或可作為AP早期治療的干預靶點。本文圍繞鈣庫操縱型鈣內流通道及鈣信號下游效應分子開展了深入系統的研究，旨在探索靶向鈣信號的新型AP早期治療的藥物靶點。

AP是消化系統的常見疾病之一，年發病率為4.9～73.4/10萬，且呈逐年上升趨勢，其中伴有全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能衰竭的SAP病死率高達30%，嚴重危及人民生命健康[1-2]。我國最常見的AP病因為膽石癥和高脂血癥，與ERCP或某些藥物如天門冬酰胺酶等相關的AP亦受到研究者的關注[3]。上述這些AP病因均可引起胰腺腺泡細胞出現病理性鈣信號，是AP發生的重要誘因。筆者所在課題組圍繞鈣信號與AP開展了系統性研究，本文擬概述細胞內病理性鈣信號與AP發生和發展的研究進展，為靶向鈣信號通路早期治療AP的干預策略提供理論依據。

一、胰腺腺泡細胞鈣超載是胰腺炎發生的重要誘因

胰腺外分泌功能單元是由胰腺腺泡細胞和胰腺導管上皮細胞共同組成。胰腺腺泡細胞合成并分泌多種消化酶和少量富含NaCl的液體；而胰腺導管上皮細胞則負責重吸收Cl-并分泌大量的HCO3-和H2O形成胰液。腺泡細胞生理性鈣信號主要表現為局限于細胞頂部的振蕩型鈣信號，是胰腺正常分泌消化酶必不可少的；病理性鈣信號主要表現為全細胞持續性、非鈣振蕩、鈣峰-鈣平臺型(peak-plateau)鈣信號，又被稱為腺泡細胞“鈣超載”。1995年英國利物浦大學Petersen和Sutton教授共同提出胰腺腺泡細胞鈣超載是AP的重要誘因[4]。之后證實幾乎所有與胰腺炎病因相關的刺激物均通過誘導腺泡細胞出現病理性鈣信號，引起細胞內酶原激活、細胞空泡化、內質網過度應激、線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)增加、ATP合成下降、壞死通路激活等一系列AP相關的病理生理學改變[5]。Raraty等[6]發現高濃度的縮膽囊素(cholecystokinin，CCK)引起小鼠胰腺腺泡細胞出現典型的鈣峰-鈣平臺型病理性鈣信號，即一個大幅度的初始鈣峰，伴隨一個延長的鈣平臺期，這與腺泡細胞內胰蛋白酶原的活化密切相關，進一步研究發現去除細胞外液中的鈣離子或使用鈣離子螯合劑(1,2-bis(O-aminophenoxy)ethane-N,N,N9,N9-tetraacetic acid，BAPTA)可抑制腺泡細胞內胰蛋白酶原的活化。Murphy等[7]報道了人腺泡細胞對高濃度的CCK亦有類似的反應。然而，人胰腺腺泡細胞是否能有效地對CCK起反應仍存在爭議[8]，且有研究提示CCK受體極少在人胰腺腺泡細胞表達[9]。膽源性胰腺炎是AP常見的病因之一。膽汁酸鹽是膽汁主要成分，其包括牛磺石膽酸鹽、牛磺膽酸鹽和牛去氧膽酸鹽等，病理情況下，膽汁酸隨膽汁反流進入胰腺，成為與膽源性胰腺炎密切相關的刺激物。Voronina等[10]發現以牛磺膽酸鈉(taurolithocholic acid 3-sulfate,TLCS)為主的多種天然膽酸鹽均可劑量依賴性地引起腺泡細胞出現病理性鈣信號，并由細胞頂部向基底部蔓延。Criddle等[11-12]報道乙醇的非氧化代謝物脂肪酸乙酯亦可引起腺泡細胞內病理性鈣信號，并進一步揭示脂肪酸乙酯是通過三磷酸肌醇受體促進鈣釋放，水解后直接抑制線粒體ATP合成，導致主要參與鈣外排的質膜鈣ATP酶功能障礙，進而加重胰腺腺泡細胞鈣超載。游離脂肪酸是高脂血癥型AP的主要刺激物，同樣可引起腺泡細胞持續性病理性鈣信號相關的細胞損傷[13]。此外，Jin等[14]還發現ERCP所用的造影劑碘海醇或碘帕醇可引起人和小鼠胰腺腺泡細胞出現病理性鈣信號，并通過激活NF-κB促炎信號通路和鈣調神經磷酸酶活化T細胞核因子軸導致腺泡細胞壞死和AP。筆者所在課題組研究發現，即使在生理濃度卡巴膽堿的刺激下，短暫性胰管內壓力升高即導致腺泡細胞出現典型的鈣峰-鈣平臺型病理性鈣信號，是胰管高壓誘發胰腺炎的重要原因[15]。Peng等[16]發現用于兒童急性淋巴細胞白血病的標準化療藥天冬酰胺酶亦通過引起腺泡細胞鈣超載并抑制ATP的合成，引起腺泡細胞壞死并誘發天冬酰胺酶相關的胰腺炎。上述研究均提示胰腺腺泡細胞鈣超載是AP的重要誘因。近年來，胰腺導管上皮細胞在胰腺炎中的作用也逐漸受到關注。臨床數據提示胰腺導管上皮細胞分泌功能障礙與AP的發生及嚴重程度呈正相關[17-18]。Hegyi團隊的研究提示，高濃度膽酸鹽、乙醇及其非氧化代謝物、脂肪酸等均可引起胰腺導管上皮細胞內鈣超載，導致導管上皮細胞分泌功能障礙和細胞壞死[19-20]。

二、鈣信號元件可作為AP早期治療的潛在干預靶點

胰腺腺泡細胞內鈣信號的轉導嚴格受到鈣信號元件的調控，這些鈣信號元件在腺泡細胞上均表達，主要包括細胞內鈣庫上表達的鈣釋放通道如三磷酸肌醇受體(inositol triphosphate receptor，IP3Rs)和蘭尼堿受體(ryanodine receptors，RyRs)、細胞膜上的鈣庫操縱型鈣內流通道(Ca2+release-activated Ca2+，CRAC)以及參與回補胞內鈣庫的肌質網膜鈣ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)和參與鈣外排的胞膜鈣ATP酶(plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA)等。聚焦鈣信號元件在AP中的作用為AP早期干預靶點提供可能性。

1．鈣釋放通道：內質網鈣釋放通道主要有IP3Rs和RyRs，研究發現IP3Rs、RyRs在人和小鼠胰腺腺泡細胞均有表達且呈極性分布[21-22]。IP3Rs有3個亞型，其中2型和3型主要表達于腺泡細胞頂部區域的內質網表面，RyRs主要是在心肌細胞等可興奮細胞表達，在腺泡細胞基底區的內質網表面也有表達。當胞內磷脂酶C被激活，催化細胞膜表面的二磷酸磷脂酰肌醇，水解產生三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)，進而與IP3Rs結合，釋放內質網里儲存的鈣離子進入細胞質并激活各種鈣離子依賴性下游信號通路。Gerasimenko等[23]發現2型IP3R單敲除(IP3R2-/-)或2型和3型IP3R雙敲除(IP3R2-/-IP3R3-/-)的胰腺腺泡細胞鈣釋放顯著下降且胰蛋白酶原的異常活化亦隨之減少；而Orabi等[24]發現，與野生型小鼠相比，IP3R2-/-小鼠雨蛙肽誘導的AP的嚴重程度差異無統計學意義。Huang等[25]的另一項研究顯示，高劑量的咖啡因可通過抑制IP3Rs介導的鈣釋放，減少腺泡細胞鈣超載，減輕多種小鼠AP模型的嚴重程度。Oribi等[24]多項研究表明RyRs介導的鈣釋放參與調控腺泡細胞內胰蛋白酶原的異常激活；RyRs特異性抑制劑丹曲林可降低雨蛙肽和膽汁酸誘導的AP的嚴重程度[26-28]。但是，鈣釋放通道在全身各臟器均廣泛表達并發揮極為重要的生理功能，這導致其調節劑對心臟等重要臟器的不良反應極難避免。因此，以鈣釋放通道作為潛在靶點開發治療AP的相關藥物或干預手段的應用前景相對較弱。

2．鈣內流通道：維持腺泡細胞內鈣持續性升高主要依賴鈣庫操縱型鈣內流(store-operated Ca2+entry, SOCE)。內質網鈣庫的排空誘導其膜上的鈣傳感蛋白(stromal interaction molecule 1, STIM1)向細胞膜轉移，并激活細胞膜上低電壓高選擇性的鈣激活鈣內流CRAC通道。2006年2篇發表在Nature上的研究證實CRAC的基本組成蛋白為Orai1[29-30]。之后，Lur等[31]首先發現Orai1在胰腺腺泡細胞的基底部和側部表達。Gerasimenko等[32]發現Orai1介導的持續性鈣內流參與乙醇及其代謝物所致的腺泡細胞內胰蛋白酶原的異常活化和細胞壞死通路的激活，抑制Orai1可顯著減輕鈣超載相關的腺泡細胞損傷。Voronina等[33]發現Orai1介導的持續性鈣內流在腺泡細胞空泡形成中發揮重要作用，抑制Orai1可阻止CCK或TLCS所致的腺泡細胞空泡化。筆者所在課題組首次使用新鮮分離的人胰腺腺泡細胞和體外分離的小鼠胰腺腺泡細胞進行研究，發現抑制Orai1可阻斷TLCS誘導的病理性、持續性鈣內流并減輕腺泡細胞內壞死通路激活；進一步研究發現抑制Orai1可顯著減輕由雨蛙肽、棕櫚油酸加乙醇、逆行膽胰管注射TLCS誘導的3種AP模型的嚴重程度，且早期(發病后1～2 h)給予Orai1抑制劑的療效顯著優于發病后6 h[34]。Waldron等[35]進一步發現Orai1抑制劑不僅可保護胰腺實質細胞，還可以通過降低中性粒細胞內活性氧的合成和促炎因子的表達來減輕AP患者的嚴重程度。上述研究中測試的Orai1抑制劑(商品名為Auxora)已在美國完成了二期臨床試驗，且研究結果表明Auxora用于治療AP和SIRS是安全可行的[36-37]。值得注意的是，Ahuja等[38]研究發現Orai1具有調控腺泡細胞抗菌肽分泌的重要生理功能，特異性敲除胰腺腺泡細胞Orai1會導致小鼠腸道菌群紊亂甚至死亡。

瞬時受體電位通道(transient receptor potential channels，TRPCs)是一種選擇性較低的陽離子通道，表達于胰腺腺泡細胞，為另一個參與介導SOCE的通道蛋白家族。Ca2+、Na+等陽離子均可通過TRPCs蛋白家族進出腺泡細胞，參與維持細胞內穩態[39]。Muallem團隊的兩項研究解析了TRPC3在AP中的作用，他們發現全身性敲除TRPC3或使用TRPC3特異性抑制劑Pyr3可抑制腺泡細胞內持續性鈣升高并阻止細胞內胰蛋白酶的異常激活，從而減輕腺泡細胞損傷并保護輕癥胰腺炎[40-41]。但敲除或抑制TRPC3僅引起50%左右的鈣內流下降，且在AP體內和體外模型中亦僅有部分保護作用，提示TRPC3并不是最主要的介導SOCE的通道，其對腺泡細胞“鈣超載”相關的損傷調控作用相對有限，可能并不能有效減輕AP的嚴重程度。

胰管內壓力升高一直被認為是多種病因如ERCP、膽石癥、腹部外傷或胰腺腫瘤導致的胰管梗阻所致胰腺炎最主要的原因[42]。Noble等[43]通過向大鼠胰管輸注造影劑模擬ERCP術后胰腺炎，發現低pH造影劑所致的胰腺中性粒細胞浸潤和胰腺炎依賴于表達在神經元上的瞬時受體電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)的激活，使用TRPV1激動劑樹脂毒素(resiniferatoxin，RTX)可顯著減輕低pH造影劑所致的胰腺損傷。Romac等[44]運用胰管高壓所致胰腺炎小鼠模型，揭示了胰管內壓力增高通過激活壓力敏感型離子通道Piezo1引起胰腺腺泡細胞內鈣信號升高并誘發胰腺炎。該團隊最新的研究進一步闡明了胰管高壓可通過激活Piezo1引起腺泡細胞內短暫性鈣升高，隨后通過活化磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)激活TRPV4引起腺泡細胞內持續性鈣升高，進而導致線粒體去極化、細胞內酶原異常活化及細胞壞死[45]。上述研究結果揭示了壓力相關的離子通道及調控機制在胰腺炎中的重要作用，為進一步探明其作為AP早期干預靶點提供了初步的實驗依據。

3．鈣外排蛋白及線粒體依賴的ATP合成：胰腺腺泡細胞鈣外排主要受PMCA調控。PMCA的活性依賴細胞內ATP水平，胰腺腺泡細胞的線粒體氧化磷酸化對維持細胞內ATP水平起關鍵作用。正常線粒體膜電位是維持線粒體氧化磷酸化和ATP合成的必要條件，而MPTP對于維持線粒體膜電位至關重要。Cyp D是線粒體基質蛋白肽基-脯氨酰順反異構酶，參與調控MPTP的開放。抑制或敲除Cyp D可提高MPTP的開放閾值，維持線粒體膜電位和細胞內ATP的合成，進而抑制胰腺腺泡細胞壞死和AP[46-47]。筆者團隊初步嘗試以盾葉薯蕷等天然產物為原料分離純化或化學修飾其母核，獲得一系列具有抑制線粒體鈣超載的活性化合物，揭示了盾葉薯蕷的提取物或開環化的薯蕷皂苷元通過抑制線粒體鈣超載，減輕細胞內活性氧的產生，抑制MPTP的異常開放，從而抑制腺泡細胞壞死通路激活，減輕AP的嚴重程度[48-49]。另有研究報道，從金菊中提取的黃酮類化合物亦可通過核因子E2相關因子2/抗氧化反應原件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/antioxidant response element, Nrf-2/ARE)介導的抗氧化途徑及維持線粒體的正常功能對AP起到保護作用[50]。

另一方面，Bruce團隊研究發現胰島素通過促進糖酵解重編程胰腺腺泡細胞的能量代謝方式來維持細胞內ATP水平及PMCA的活性，進而直接保護氧化應激或脂肪酸等所致的細胞壞死[51-52]。該團隊的最新研究進一步揭示了內源性胰島素在AP體外模型中的作用機制，主要是通過胰島素受體引起Akt介導的磷酸果糖激酶的磷酸化來促進糖酵解[53]。上述研究結果表明直接增強或維持PMCA的活性亦可作為AP的治療策略。PMCA是由10個跨膜區和4個主要的胞質區組成的單條多肽鏈，包括PMCA1、PMCA2、PMCA3和PMCA4a/b 4個亞型[54]。胰腺腺泡細胞主要表達PMCA1和PMCA4b。Wang等[55]發現PMCA4b是一種腎臟內源性分泌型黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶renalase的結合蛋白。Kolodecik等[56]研究發現血清renalase水平在AP早期顯著下降，隨著胰腺損傷的逐漸消退而恢復至正常水平，并進一步揭示外源性補充renalase通過與PMCA4b結合促進腺泡細胞鈣外排來減輕雨蛙肽誘導的AP的嚴重程度[56]。

三、與鈣信號相關的基因突變與胰腺炎

遺傳因素在胰腺炎特別是急性復發性胰腺炎或CP的致病過程中起重要作用，主要的易感基因包括胰蛋白酶原基因(protease serine 1，PRSS1)、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(serine protease inhibitor Kazal type1，SPINK1)、囊性纖維跨膜轉導調控因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)、糜蛋白酶C(chymotrypsin C，CTRC)、鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)、緊密連接蛋白(claudin 2，CLDN2)等[57]。近年來，有不少研究分別報道了與鈣信號相關的基因突變如CaSR、TRPV6、STIM1等參與胰腺炎的發生。CaSR是細胞膜受體，可以感知細胞外鈣水平，在胰腺腺泡和導管細胞中均有表達[58]，CaSR通過觸發導管電解質和液體的分泌從而監測和調節胰液中鈣濃度[59]。Felderbauer等[60]首次報道CasR在第7外顯子(R896H)中有一個錯義突變，在第4外顯子(F391F)和第7外顯子(E790E)中有兩個保守突變，與SPINK1聯合突變增加了患胰腺炎的風險。Muddana等[61]研究發現CaSR突變普遍出現在中度至重度飲酒的CP患者中。TRPV6是一種高度選擇性的離子通道，敲除TRPV6會造成鈣穩態失衡，表現為腸道吸收鈣離子降低、低體重、生育能力下降等。Masamune等[62]發現在非酒精性CP患者中TRPV6突變頻率顯著增高，尤其是突變體p.Glu575Lys和p.Arg345His會導致TRPV6功能性缺陷，作者進一步在雨蛙素誘導的胰腺炎小鼠模型中發現TRPV6 突變小鼠的胰腺炎病情比對照組小鼠更嚴重。Zou等[63]在中國人群中亦有類似發現。此外，Burgos等[64]發現CP中位于基質相互作用分子1(strmal interaction molecule 1,STIM1)蛋白的一個結構域和無菌α-motif結構域內的p.E152K突變增加了成纖維細胞和HEK293T細胞內質網鈣的釋放，導致鈣穩態失調，酶原激活進而引起細胞壞死。上述研究從另一方面亦證實了細胞內異常鈣信號和鈣信號元件在胰腺炎發生中的重要地位。

四、鈣調神經磷酸酶是轉導胰腺損傷信號的鈣信號下游效應分子之一

過去已報道的轉導胰腺損傷細胞的鈣信號下游效應分子包括鈣調節蛋白(calmodulin，CaM)，鈣依賴的蛋白激酶如蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的α、β、γ亞型，鈣激活酶(calpains)和鈣調神經磷酸酶等。Gerasimenk等[65]發現CaM可通過抑制2型和3型IP3R顯著降低乙醇誘導的鈣釋放和胰蛋白酶原的異常活化。Han等[66]發現高濃度CCK刺激可引起腺泡細胞內鈣離子濃度異常升高并活化PKC，促進CCK8趨化因子mob-1的表達和NF-κB的活化。鈣依賴的鈣激活酶calpain抑制劑可緩解胰腺炎的嚴重程度[67-68]。此外，Husain團隊的多項研究發現，鈣調神經磷酸酶在AP發生和發展中相對特異且發揮極為重要的調控作用[69-71]。鈣調神經磷酸酶作為腺泡細胞內鈣信號異常升高的關鍵效應分子，參與介導雨蛙肽及膽酸誘導的胰腺炎中胰蛋白酶原的異常激活，且鈣調神經磷酸酶抑制劑可阻斷PKC-δ亞型的轉錄，抑制NF-κB的轉錄激活并減輕胰腺炎的嚴重程度[72]。筆者所在課題組[15]通過建立胰管高壓所致AP小鼠模型闡明短暫性胰管內壓力增高引起腺泡細胞鈣信號失衡、鈣調神經磷酸酶異常活化和誘發胰腺炎的分子機制；通過膽胰管輸注帶有活化T細胞核因子啟動子的生物熒光素酶報告腺相關病毒載體，實現了體內動態監測胰腺局部鈣調神經磷酸酶的活化情況并發現短暫性胰管內壓力升高會激活胰腺內鈣調神經磷酸酶通路；進一步發現全身性敲除鈣調神經磷酸酶催化亞基(CnAβ-/-)或腹腔注射鈣調神經磷酸酶抑制劑FK506均顯著減輕胰管高壓所致AP的嚴重程度。團隊另一項研究[73]則通過兩種不同方式建立胰腺腺泡細胞特異性鈣調神經磷酸酶敲除小鼠模型(Ela-CreERT2/Cnb1f/f和AAV6-Ela-iCre膽胰管輸注到Cnb1f/f小鼠胰腺局部)，明確腺泡細胞來源的鈣調神經磷酸酶在ERCP術后胰腺炎中起主要的調控作用，且在ERCP 術后胰腺炎造模的同時單次低劑量胰腺局部給予鈣調神經磷酸酶抑制劑即可顯著降低ERCP術后胰腺炎的風險。此外，鈣調神經磷酸酶在全身各器官和組織廣泛表達。Wen等[74]首次通過骨髓移植的方式建立骨髓特異性鈣調神經磷酸酶敲除小鼠，發現表達于免疫細胞的鈣調神經磷酸酶不影響AP時胰腺局部壞死的程度，而主要參與調控胰外器官功能不全，特別是胰腺炎相關的肺損傷；且AP時主要浸潤于肺部并發揮重要調控作用的免疫細胞為中性粒細胞，抑制中性粒細胞鈣調神經磷酸酶可顯著抑制其趨化性和細胞內活性氧合成。來自美國賓夕法尼亞大學Thiruvengadam等[75]的一項臨床研究進一步證實鈣調神經磷酸酶抑制劑他克莫司聯合吲哚美辛栓劑能安全有效地預防ERCP術后胰腺炎的發生。上述研究結果提示鈣調神經磷酸酶抑制劑或可作為AP的早期治療手段或ERCP術后胰腺炎的防治手段。

五、小結與展望

胰腺腺泡細胞鈣超載被證實是AP發生的重要誘因。胰腺腺泡細胞內鈣信號的轉導受細胞內鈣信號元件嚴格調控，這些鈣信號元件或可作為AP早期治療的干預靶點。鈣庫操縱型鈣內流通道Orai1抑制劑作為目前唯一專門針對AP發病機制的在研新藥，已在美國完成二期臨床試驗并有望成為第一個FDA批準的治療AP的臨床藥物。隨著基礎研究的繼續開展，針對鈣信號元件如何參與調控AP發生、發展的認識和理解將進一步增強，并有望獲得更多靶向細胞內病理性鈣信號治療AP的新策略和干預靶點，這對降低AP早期死亡率及提高患者長期生活質量具有重要的臨床價值。

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