蘆筍主要病毒病的研究進展

葉艷英，尹玉玲，張冰冰，湯泳萍，周勁松，羅紹春

（江西省農業科學院蔬菜花卉研究所，江西南昌 330200）

蘆筍（Asparagus officinalisL.）又名石刁柏，為天門冬科天門冬屬多年生宿根性草本植物，其嫩莖質嫩味美，風味獨特，是一種深受消費者喜愛的營養保健型高檔蔬菜，被譽為“蔬菜之王”[1]。蘆筍富含甾體皂苷、黃酮類、維生素、膳食纖維及植物多糖等多種活性成分，具有很好的藥用價值和保健功能[2-3]。2020 年蘆筍已正式列入新型冠狀病毒肺炎中醫診療方案及預防方案藥食同源目錄[4]。我國蘆筍產業發展迅速，2016 年栽培面積已達12 萬hm2，蘆筍的播種面積和出口量均超過世界總量的50%，年產值達數百億元[5]。

目前，在多國發現蘆筍受到衰退綜合癥的影響，這種綜合癥縮短了蘆筍的生產年限，也降低了蘆筍的產量和質量，病毒病是引起衰退綜合癥的一個重要原因，并可使蘆筍植株更易受到生物和非生物脅迫[6]。至今在蘆筍上發現了10 種病毒：擬南芥花葉病毒(ArMV)、草莓潛伏黃斑病毒(SLRSV)、番茄黑環病毒(TBRV)、煙草條紋病毒（TSV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒(TMV)、苜蓿花葉病毒(AMV)、天 門 冬1 號 病 毒(AV-1)、天 門 冬2 號 病毒(AV-2)和 天 門 冬3 號 病 毒（AV-3）[7-9]。其 中，AV-1、AV-2 和AV-3 這3 種 病 毒，蘆 筍 是 天 然 的宿主。AV-1 和AV-2 在北美與歐洲的商業蘆筍田很常見，這2 種病毒也是大陸蘆筍的最主要病毒，而AV-3 只在日本發現[10]。TSV 和CMV 最早分別于丹麥和德國被發現，其他的幾種病毒病發生較少。筆者對主要的蘆筍病毒病的研究進展進行概述，旨在為蘆筍病毒相關研究提供借鑒，為培育優質高產的蘆筍提供理論和實踐基礎。

1 天門冬1 號病毒（AV-1）

1.1 AV-1 基因組結構

天門冬1 號病毒（AV-1）是馬鈴薯Y 病毒科馬鈴薯Y 病毒屬的成員，AV-1 是一種彎曲的絲狀病毒，長770～790 nm，寬13 nm[11]。AV-1 是單鏈正義RNA 病毒，基因組長度為9 741 nt，不包括3′端多聚poly（A）尾，編碼一個包含3 112 個氨基酸的多聚蛋白，分子質量為342 ku[12]。

AV-1 基因組RNA 的5′末端連帽狀病毒編碼的VPg 蛋白，3′末端由poly（A）尾巴組成，編碼區為單一開放閱讀框（ORF）。ORF 可表達產生一個多聚蛋白前體，包含10 種蛋白：P1 蛋白（333aa）、HCPro 輔助蛋白酶（458aa）、P3 蛋白（351aa）、6K1 蛋白（52aa）、CI 柱 狀 包 含 體 蛋 白（643aa）、6K2 蛋 白（53aa）、VPg 病毒基因組連接蛋白（193aa）、NIa 核內含體蛋白a（243aa）、NIb 核內含體蛋白b（518aa）和CP 外殼蛋白（268aa）。

筆者對NCBI 上登錄的16 個AV-1 分離物的CP基因進行序列比對分析，16 個分離物的CP基因均為443 個堿基。16 個分離物的CP基因同源性高，核苷酸序列同源性在96.8%～100%，氨基酸同源性在95.2%～100%。

1.2 AV-1 對蘆筍的危害

TOMASSOLI 等[6]對西西里島和坎帕尼亞采集的650 多個蘆筍樣品進行檢測，54%樣品檢測出AV-1，86%取樣點發現有被病毒侵染，發病率最高的是老植株。

蘆筍感染病毒病會影響其質量，導致彎曲筍、細筍、散頭筍明顯增多，同時會使植株變得瘦弱，嚴重影響蘆筍品質。由于感染病毒的植株沒有明顯癥狀，因此，常常被忽視其造成的經濟損害[13]。歐洲種植的蘆筍感染AV-1，減產可達30%～70%[13-14]；對云南燕山縣蘆筍病害調查發現，由于AV-1 危害導致蘆筍產量下降了25%[15]；受AV-1 危害，蘆筍莖長降低了12%～20%、莖質量降低了10%～33%[16]。

1.3 侵染途徑

在蘆筍中發現了3 種機械傳播的病毒：TSV、AV-1 和AV-2[17-18]。AV-1 同絕大多數的馬鈴薯Y病毒一樣,是以非持續性傳播。除了機械傳播外，還主要通過桃蚜與豆蚜傳播，不通過種子進行傳播。

2 天門冬2 號病毒（AV-2）

2.1 AV-2 基因組結構

天門冬2 號病毒(AV-2)是雀麥花葉病毒科等軸不穩定環斑病毒屬第2 亞組中的一員，是一種小型球形病毒[11]。AV-2 基因組結構為三分體正義單鏈mRNA，5′末端有帽狀結構，3′末端無poly（A）尾巴。AV-2 全基因組由RNA1、RNA2、RNA3 和亞基 因 組RNA4 組成[19]。RNA1 的長度是3 431 nt，是一個單一的ORF，編碼P1 蛋白，含有1 076 個氨基酸，分子質量為121 ku，同時包含一個甲基轉移酶區 域 和 解 旋 酶 信 號，RNA1 的5′UTR 和3′UTR 分別為72、128 nt。RNA2 的長度為2 916 nt，其ORF的5′端編碼P2 蛋白，含790 個氨基酸，分子質量91 ku，包含聚合酶信號，ORF 的3′端編碼2b 蛋白，含193 個氨基酸的，分子質量21 ku。RNA2 的5′UTR 和3′UTR 分別為72、194 nt。RNA3 包含2 個ORF，ORF1 編碼運動蛋白MP，含281 個氨基酸，MP 是參與病毒在細胞和細胞間運動的重要蛋白，ORF2 編碼外殼蛋白CP，含217 個氨基酸。CP 是由RNA3后半部分對應的亞基因組RNA4翻譯[19-20]。

筆者對AV-2 的7 個分離物的CP基因進行序列比對分析，7 個分離物的CP基因均為654 個堿基，編碼217 個氨基酸。核苷酸序列同源性在99.1%～100%，核苷酸在240、314、439、446、465 和555 位置處存在差異。氨基酸同源性在99.1%～100%，氨基酸在105 和149 位置處存在差異。發現AV-2 分離株的外殼蛋白(CP)的遺傳變異性非常低，且均高度保守，在分離株間具有大于99%的同源性，這與SHIMURA 等[21]的研究結果相一致。

對AV-2 的7 個分離物的2b基因進行序列比對分析，7 個分離物的2b基因均為582 個堿基，編碼193 個氨基酸。核苷酸序列同源性在99.3%～100%，核苷酸在51、166、167 和194 位置處存在差異。氨基酸同源性在98.5%～99.5%，氨基酸在56和65 位置處存在差異。

2.2 AV-2 對蘆筍的危害

2.2.1 病毒發病率高 據調查統計，密歇根蘆筍種植田有50%～70%的植株感染AV-2，且大多數是種植了5 a 以上的植株[22]。當蘆筍父本感染AV-2時，子代幼苗中有16.7%植株攜帶AV-2；只有母本感染時，子代幼苗中有46.6%植株攜帶AV-2；當父母本都感染時，有94.5% 子代植株攜帶AV-2[23]。

2.2.2 影響品質和產量 蘆筍感染了AV-2，導致減產大約25%，在收獲期1～5 a，商品筍平均產量分別降低14%、28%、20%、48%和57%，次品筍產量分別提高93%、105%、207%、352%和167%；未受AV-2 危害的植株商品筍產量逐年增加，直到第5 年到達高峰，而受AV-2 危害的植株產量增長到第3 年后便開始逐年下降[24]。

2.2.3 影響授粉和種子質量 蘆筍感染病毒對幼苗適宜性、植株的生長、授粉能力和種子發芽率都有顯著影響。蘆筍親本植株感染AV-2 可導致花朵發育受損，會使授粉成功率降低21%～29%，種子質量減少11%～8%，種子數量減少12%～46%，種子萌發率降低8～23%，蘆筍幼苗活力下降4%～15%[23]。

張連長還想爭辯,曲干事把他扯到一旁,低聲說:“我不是裝好人,明擺著,只能先收在你們連了!這老爺子要不高興起來,團長也會不高興,師長也會不高興,這點事兒你都不懂?”

2.2.4 影響幼苗生長 蘆筍幼苗感染AV-2 時，植株的生長速度和活力都會降低，AV-1 和AV-2 這2 種病毒同時存在時，蘆筍植株在發病2 a 后會出現嚴重的衰退和死亡[17]。AV-l 或AV-2 單一感染時導致蘆筍幼苗生長和存活率下降10%～20%，而AV-l 和AV-2 雙重感染時則使蘆筍幼苗生長和存活率下降40%～70%[24]。

2.2.5 影響組培快繁 此外，蘆筍病毒病對蘆筍快繁可產生影響，會降低外植體的生根率和存活率，無病毒的外植體生根率為40%～45%。感染病毒的植株上取的外植體在組培過程中根系發育緩慢，存活率降低15%～75%，培養28 d 后，感染AV-1的蘆筍組培苗生根率為14%～30%，感染AV-2 的生根率為28%～32%，感染2 種病毒的外植體生根率僅為6%～20%[25]。

2.3 侵染途徑

AV-2 主要是通過機械和種子傳播[26-27]。蘆筍是一種異花授粉的植物，通過風吹傳播或蜜蜂攜帶花粉以及薊馬的攝食活動等方式傳播，AV-2 通過花粉傳播可使病毒傳入健康的植株，使其在植株內迅速傳播[20,22]。EVANS 等[22]從感染AV-2 的蘆筍植株花粉中檢測到AV-2 的病毒粒子，并在花粉外膜上定位到病毒抗原，證實AV-2 可通過授粉活動進行傳播。另外，農事操作如用被AV-2 污染的切刀或者割草機等切割母莖也是機械傳播AV-2 的途徑之一，且易在較老的植株中廣泛傳播。

蘆筍種子感染AV-2達5%～60%，平均為22%。由于種子感染AV-2 比例高，因此，受感染的種子是AV-2 最初進行傳播的最可能來源，攜帶AV-2的種子進行交流可能會把AV-2 傳播到全世界，特別是在偏遠地區和新西蘭等島國，意大利[28]、北美[17]和新西蘭[29]蘆筍感染AV-2 的比例也很高。

3 蘆筍其他病毒病

3.1 天門冬3 號病毒（AV-3）

AV-3 最早從日本的蘆筍中分離出來,被歸類為馬鈴薯X 病毒屬的成員。AV-3 的全基因組長度為6 937 nt，不包括poly（A）尾，5′UTR 和3′UTR 分別為81、101 nt。基因組RNA 中包括5 個ORF，ORF1（82～4 926 nt）編碼一個182 ku 的RNA 聚合酶（RdRp），ORF2（4 959～5 702 nt）、ORF3（5 635～5 994 nt）和ORF4（5 837～6 094 nt）分別編碼28 ku TGBp1、13 ku TGBp2 和9 ku TGBp3 的 蛋 白 質，稱為三基因阻斷蛋白（TGBps），ORF5（6 144～6 836 nt）編碼26 ku 的外殼蛋白（CP）[11]。到目前為止，除日本外，還沒有其他國家報道該病毒，因此，關于其特性和對產量影響的相關信息較少。

3.2 黃瓜花葉病毒（CMV）

CMV 是黃瓜病毒科黃瓜病毒屬中的一員。蘆筍上CMV 最早在德國發現[30]。受CMV 感染的蘆筍無典型癥狀，CMV 可以通過超過80 種蚜蟲以非持久性的方式進行傳播。CMV 的蘆筍分離物很容易通過機械方式接種到藜麥和莧屬等草本指示植物上，接種后引起葉片典型局部病變，以及系統花葉[10]。CMV 已知在至少20 種植物中通過種子傳播，但沒有關于CMV 病毒通過種子和花粉在蘆筍中傳播的報道。發現蘆筍上經常混合感染CMV 與AV-1，同時感染2 種病毒對蘆筍產量的影響更大，如感染AV-1+CMV 造成蘆筍減產,最高可達70%；感染AV-2+CMV 可導致減產20%～49.5%[12]。

3.3 煙草條紋病毒（TSV）

TSV 是等軸不穩環斑病毒屬中的一員，蘆筍上的TSV 最早在丹麥的蘆筍中被分離出來，然后根據生物學、物理和血清學特性，該分離物被證明與TSV 有關[10]。美國加州的蘆筍在自然條件下也可感染TSV，但地中海國家的蘆筍上未檢測到TSV。感染TSV 的蘆筍植株發育不良，莖部呈褪綠或褐色條紋，擬葉變褐色，TSV 在蘆筍中不能通過種子傳播，但可以通過薊馬攜帶傳播[31]。

4 蘆筍病毒病的檢測方法

4.1 指示植物法

藜麥是很好的指示植物,用于檢測AV-1 的存在與否，藜麥接種AV-1 病毒4～12 d 后，接種葉上出現褪綠、紅棕色或黃色斑點，而后受影響的組織開始壞死[30]。另外，本氏煙也可用于鑒別AV-1 分離株[32]。

4.2 血清學檢測法

JASPERS 等[17]使用酶聯免疫吸附法（ELISA）成功檢測了蘆筍枝條AV-2的感染情況。HOWELL等[33]采用血清學法區別不同地域來源的AV-1 病毒株系。此外，蘆筍CMV 病毒也可通過ELISA 進行檢測[30]。

4.3 電鏡觀察法

電鏡法是通過觀察病毒顆粒形態、大小、結構、內涵體組成和亞結構等特征來確定蘆筍病毒是否存在。FUJISAWA[8]通過提純分離蘆筍病毒粒子，用提純液來做電鏡制片，觀察到了AV-3 的粒子形態結構。LI 等[15]利用電子顯微技術觀測到國內首例AV-1 病毒長度等。

4.4 分子生物學檢測法

分子生物學檢測法比血清學法的靈敏度要高,特異性強，有著更快的檢測速度，操作也比較簡便，可用于大量樣品的檢測。TOMASSOLI 等[6]利用AV-1 病毒外殼蛋白CP 區域設計特異引物，建立RT-PCR 反應體系，對不同地區采集的蘆筍樣品進行AV-1 檢測。JASPERS 等[17]利用已發表的AV-2 外殼蛋白核苷酸序列（Genbank 登錄號×86352）設計引物，用于檢測AV-2。

5 蘆筍病毒病的防治

5.1 選育抗病品種

選育抗病毒品種是防治病毒病的最有效措施，目前研究者們發現了對蘆筍病毒病具有抗性的資源。TOMASSOLI 等[34]研究表明，蘆筍野生近緣種A. maritimus感染病毒率低于10%。此外，TIBERINI 等[35]在意大利蘆筍田中發現A. albus、A.amarus、A. stipularis和A. horridus無AV-1 感染。NOTHNAGEL 等[36-37]對44 個蘆筍栽培種、基因文庫和育種系以及34 個蘆筍野生近緣種進行AV-1 抗性評價，發現A.amarus、A.verticillatus、A.prostratus、A.maritimus、A.acutifolius和A.stipularis未檢測到AV-1，這些抗性種質資源由二倍體、四倍體和六倍體組成，分別來自歐亞和非洲，其中，地中海野生近緣種A. amarus對AV-1 具有完全抗性，且A.amarus為六倍體。這些抗性資源的發掘為蘆筍抗病毒病育種提供了新的契機。

5.2 農業措施

蘆筍種子攜帶病毒是重要的毒源，因此，在播種前對種子進行消毒處理能在一定程度上降低病毒病發生的可能性。合理密植、合理施肥、灌溉、培育壯苗、拔除早期病株、農具與機械進行消毒消除潛在病毒等措施可減輕病害發生[38-39]。

5.3 傳播介體防控

傳播介體主要是蚜蟲、粉虱、薊馬等，可通過阻礙傳播媒介傳播，達到防治病毒目的[40]。物理防治：利用黃板或藍板、性誘劑等趨避蚜蟲、粉虱、薊馬，大棚的通風口安裝防蟲網進行隔離。生物防治：可通過釋放捕食性或寄生性天敵的方式防治薊馬，從而減少蘆筍病毒病的發生。化學防治：在蘆筍生長過程中，使用高效、低毒、低殘留農藥防控蚜蟲、粉虱、薊馬。

6 展望

蘆筍質嫩味美、富含生物活性因子，具有很好的藥用保健功效，且被列入新型冠狀病毒肺炎中醫診療方案預防方案目錄。近年來，國內蘆筍產業發展速度迅速，產業規模不斷擴大。蘆筍病毒病使蘆筍產量降低，使蘆筍散頭造成商品性大打折扣，影響出口創匯。筆者認為今后應該從以下幾個方面開展研究：（1）建立脫毒種苗繁育體系。目前，并無抗病毒病的蘆筍品種，而蘆筍主要傳播途徑之一是帶病毒的種子進行傳播，因此，獲得優良的蘆筍脫毒苗是當前防治蘆筍病毒病的主要方法之一，所以，對蘆筍進行莖尖脫毒種苗快速繁育研究尤為重要。（2）建立快速、簡便、特異性強的蘆筍病毒病檢測方法。筆者發現很多蘆筍園中有疑似病毒病的植株，因此，建立快捷檢測方法為更好地研究蘆筍病毒在田間的侵染率、發生情況等方面提供依據，也為脫毒種苗的生產提供了技術保障，是有效開展蘆筍病毒病綜合防治工作的關鍵，對蘆筍的穩產、高產具有重要的現實意義。（3）加強抗病毒資源鑒定、篩選與利用。目前為止還沒有育成抗病毒的品種，主要是因為品種的共同起源導致遺傳背景狹窄。防治蘆筍病毒病最經濟且有效的方法就是發掘天然的抗病毒病的種質資源和抗病毒基因，利用野生近緣植物作為抗性來源是現代植物育種的常用策略。將發掘的高抗病毒病的蘆筍野生近緣種通過種間雜交、胚胎拯救和離體再生技術有可能將野生種中的抗性轉移到栽培種中[41-42]。這為今后培育抗病毒病的蘆筍品種提供了可能，因此，應加強對抗性資源的鑒定、篩選和開發利用。另外，應加快蘆筍病毒病致病的分子機理和植物抗病毒病的分子機理等方面的基礎研究。