液相色譜-原子熒光聯用測定海水及濃鹽水中硒形態

李艷蘋，王翠翠，趙劍超，馬明遠，劉小騏，高 艾

(自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

0 引 言

元素在環境中的效應與它的總量有關，更與它存在的化學形態緊密相關[1-2]。硒元素具有抗氧化、抗癌以及拮抗重金屬毒性的作用，是動物和人體需要的有益痕量元素，但是環境中過量的硒又會致人、畜中毒[3]，以及腸胃功能紊亂、神經功能障礙等，或對生態系統構成威脅[4]。總之，硒元素具有“雙重性”的特點[5]，其生物有效性、毒性以及代謝規律與硒存在的形態密切相關，因此引起廣大學者的研究和關注。目前硒形態分析的研究已有很多報道，包括食品[6-7]、水產品[8]、生物樣品[9]、土壤[10]等領域，但在環境水領域，尤其是海水中的硒形態分析研究較少，開展海水及濃鹽水中硒元素的形態分析研究，可為水資源綜合利用以及海洋環境質量評估提供分析手段[11]。

隨著痕量元素形態分析技術的發展，聯用技術已成為元素形態分析的主要手段，它是將離子色譜（IC）、毛細管電泳（CE）、高效液相色譜法（HPLC）等分離技術與原子熒光光譜法（AFS）、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）等檢測技術，通過在線連接整合，形成一種更快速、更有效的分離和測試技術，具有很高的選擇性和靈敏性，有很大的應用優勢和應用前景。目前使用較多的是高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法 (HPLC-ICP-MS)和高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法(HPLC-HGAFS)。ICP-MS法具有較寬的線性范圍、靈敏度高、干擾少，以及可同時測定多元素或多同位素等優點[12]。但由于該儀器價格昂貴、運行費用較高以及需要精心維護等方面，在實際應用中受到了一定的限制[13]。HPLC-HG-AFS不僅儀器操作簡單、分析成本低，而且也具有高選擇性、高靈敏性、線性范圍寬等特點[14-15]，目前已廣泛應用于砷、汞、硒等元素的形態分析。如有文獻報道HPLC-ICP-MS測定海水中的硒形態[16]，HPLC-HG-AFS測定海水中的砷形態[14]，但是還沒有用HPLC-HG-AFS聯用技術進行海水及濃鹽水復雜基體中有機和無機硒形態測定的研究。

本實驗采用HPLC-HG-AFS聯用技術對海水及濃鹽水中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸根（SeO42-）4種硒形態進行了測定分析，對有機硒和無機硒有較好的分離效果，方法準確度高、精密度好，簡便快速，為海水及濃鹽水中硒形態分析的有效手段。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

ST3100型實驗室酸度計（奧豪斯儀器公司）；Milli-Q型實驗室超純水系統（美國密理博公司）；KQ3200B型臺式超聲波儀（昆山超聲儀器公司）；6500型液相色譜-原子熒光聯用儀（北京海光儀器公司）。

硒代胱氨酸溶液標準物質、甲基硒代半胱氨酸溶液標準物質、硒代蛋氨酸溶液標準物質、硒酸根溶液標準物質（以 Se計分別為：44.2 μg/g、34.8 μg/g、39.4 μg/g、41.5 μg/g，中國計量科學研究院）；檸檬酸（GR，天津市光復科技公司）；CaCl2、KCl、NaCl、MgCl2·6H2O、MgSO4·7H2O、（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；KOH（GR，天津津科精細化工研究所）；HCl（GR，天津風船化學試劑公司）；KBH4（GR，東方化工廠）。

1.2 儀器參數

原子熒光工作參數：硒元素燈（主電流80 mA/輔電流40 mA）；載氣流量300 mL/min；屏蔽氣流量 900 mL/min；負高壓：300 V；載流 15% HCl；還原劑0.5% KOH+2.5% KBH4。

液相色譜工作參數：流動相30 mmol/L檸檬酸溶液（pH 4，2% 甲醇）；Hamilton PRP-X100離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；等度洗脫；泵轉速60 r/min；流量 1.0 mL/min；進樣體積為 100 μL；開啟紫外消解模式。

1.3 樣品處理

采用聚乙烯塑料瓶存放樣品，使用前將聚乙烯塑料瓶浸泡在硝酸溶液（1+3）中24 h，然后用純水清洗，晾干備用。海水及鹽水樣品通過0.45 μm水系微孔濾膜過濾，加硝酸至pH小于2，冷藏存放。

2 結果與討論

2.1 載流酸度的影響

考察了載流5%～25% HCl對4種硒形態SeCys2、MeSeCys、SeMet及SeO42-測定的影響。結果表明，4種硒形態在不同載流條件下的保留時間基本一致，當載流為5% HCl時，SeCys2和 SeMet兩種硒形態沒有出峰；當載流在10%～25% HCl范圍內，SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-4種硒形態均出峰，分離效果較好；當載流為15% HCl時，SeMet信號最強；隨著載流酸度增大，SeMet信號減弱，MeSeCys和SeO42-信號略有減弱；為了減少試劑消耗，綜合考慮選定15% HCl作為載流。

2.2 還原劑的影響

文獻[17]表明，KBH4的用量較大地影響分析的準確度和靈敏度，而且KBH4的水溶液不夠穩定，需加入適量的KOH來提高還原劑的穩定性。本實驗在0.5% KOH的溶液中分別加入1.5%～5.5% KBH4，考察還原劑對4種硒形態測定的影響。結果表明，4種硒形態的保留時間基本不變，隨著KBH4濃度從1.5%增大至2.5%，4種硒形態信號增至最大，但隨著KBH4濃度從2.5%繼續增大至5.5%，4種硒形態信號均有不同程度的減弱，最終選定還原劑濃度為2.5% KBH4+ 0.5% KOH。

2.3 碘化鉀的影響

在0.05% KOH的溶液中分別加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的KI，考察碘化鉀用量對硒形態測定的影響。實驗表明，隨著KI的增大，除SeCys2信號先增大后減弱外，其他3種硒形態峰信號逐漸增強，其中SeMet增強最為明顯，因此選定碘化鉀為0.25% 。

2.4 流動相pH的優化

由于流動相的pH對硒形態的出峰順序、保留時間以及分離效果有著很大的影響[16]。分別配制不同pH的流動相，考察了流動相pH對硒形態測定的影響，結果如圖1所示。流動相pH對SeO42-的分離影響較大，pH在3～7范圍內，隨著pH的增大，SeCys2和MeSeCys的保留時間逐漸增大，SeMet的保留時間逐漸減小，而SeO42-的保留時間先減小后增大；當pH為3，在10 min時SeO42-形態仍未出峰；當pH為4時，SeO42-峰形更尖銳；當pH為5時，SeO42-的保留時間最小，但與SeMet的色譜峰大部分發生重疊；綜合分離效果，選擇pH為4的檸檬酸溶液作為流動相。

圖1 pH對硒形態保留時間的影響

2.5 流動相濃度的優化

對流動相濃度進行了實驗優化，結果如圖2所示。當流動相濃度為10 mmol/L時，可分離出SeCys2、MeSeCys和 SeMet三種形態，SeO42-未出峰。當流動相濃度從20 mmol/L增至50 mmol/L，SeCys2和MeSeCys的保留時間基本不變，SeMet的保留時間先減小后增大，但變化不大，而SeO42-的保留時間逐漸變小，變化很大；當流動相濃度為50 mmol/L，SeMet與SeO42-色譜峰不能分開，有部分重疊；當流動相濃度為40 mmol/L時，SeMet色譜峰出現較大鼓包；當流動相濃度為35 mmol/L，可在6.75 min 內完成4種形態分離，但是MeSeCys的信號明顯減弱。為了較快完成形態分離，并保證信號強度，選擇流動相濃度為30 mmol/L。

圖2 流動相濃度對硒形態保留時間的影響

2.6 基體的影響

樣品基體鹽度（S）對硒形態測定的影響見圖3。實驗表明，當S在8.5～55范圍內，SeCys2與MeSeCys的保留時間基本不變，SeMet的保留時間變化不大，SeO42-的保留時間變化較大，其中隨著鹽度的增大，SeMet的保留時間逐漸減小，SeO42-的保留時間逐漸增大。當S在35～55之間，4種硒形態的保留時間變化較小。當S=55時，SeCys2與MeSeCys的色譜峰不能完全分開。據保留時間和分離度的情況，當海水樣品S≤45時，可以按照基體匹配法進行硒形態的測定；當海水及濃鹽水樣品S≥45時，可以考慮將樣品適當稀釋進行測定。

圖3 鹽度對硒形態測定的影響

2.7 4種硒形態的工作曲線

在優化的實驗條件下，測試人工海水配制的硒形態混合標準系列溶液，以各濃度點對相應的峰面積繪制工作曲線，獲得線性方程。具體結果見表1，在5～200 μg/L范圍內4種硒形態的線性相關系數均優于0.998，在進樣量為100 μL，等度洗脫的模式下，SeCys2、MeSeCys、SeMet和 SeO42-的檢出限分別為 2.40 μg/L、0.50 μg/L、1.97 μg/L 和 0.53 μg/L，檢出限比文獻 [18]報道的 SeCys2、SeMet、SeO42-（分別為 4 μg/L、18 μg/L 和 3 μg/L）和文獻 [7]報道的SeCys2、MeSeCys、SeMet、SeO42-（分別為3.7 μg/L、1.7 μg/L、4.2 μg/L 和7.2 μg/L）低。SeCys2、MeSeCys、SeMet和 SeO42-的保留時間分別為 2.261 min、2.804 min、4.051 min和8.057 min，硒形態標準溶液的色譜圖見圖4。

表1 4種硒形態的工作曲線

圖4 硒形態標準溶液的色譜圖

2.8 海水樣品的測定、精密度及加標回收率

對海水及人工鹽水進行了加標回收及精密度實驗，結果分別見表2和表3。

表2 加標回收試驗結果

表3 精密度試驗結果

對加標前后的海水樣品分別進行了測試，從表2可以看出，當加標量為 5～45 μg/L 時，SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-的加標回收率在77.5%～119%之間，回收率良好；對海水和人工鹽水加標樣品進行了3次的測定，4種硒形態的相對標準偏差為3.5%～12.5%。另外對一人工鹽水樣品進行了7次測定，結果見表3，4種硒形態的相對標準偏差在7.3%～11.3%之間，精密度良好。該測定方法的回收率及精密度滿足標準GB/T 27417—2017 《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的要求，其中GB/T 27417—2017標準規定濃度水平＜0.1 mg/kg，回收率的偏差允許范圍為60%～120%；被測組分在1～100 μg/L之間，其實驗室內變異系數允許為15%～30%。

3 結束語

本研究建立了高效液相色譜-氫化物-原子熒光光譜測定海水及濃鹽水中硒形態的方法。經實驗優化了分析條件：氫化發生反應條件為載流15% HCl，還原劑2.5% KBH4+ 0.5% KOH，碘化鉀0.25%，色譜分離的流動相為30 mmol/L（pH 4）的檸檬酸緩沖溶液。該方法采用Hamilton PRP-X100交換柱，在優化實驗條件下分離和測定，精密度好，回收率高，滿足分析檢測的要求，不需進行特殊前處理，操作簡便、快速，可在8.5 min內完成SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-4種硒形態的分離，可用于海水、濃鹽水及海水綜合利用排放水中硒形態的測定。