近紅外二區熒光活體成像在細胞示蹤上的應用進展

李惠珠 陳 俊

（復旦大學附屬華山醫院運動醫學科 上海 200040）

近紅外（near-infrared，NIR）光因具有組織穿透性高、自發熒光信號低等特性［1］，被譽為 “治療光” 、 “可見光” ，廣泛應用于醫療領域中的診斷和治療。近紅外光即指波長為650~1 700 nm 的光，又分為近紅外一區光（NIR-Ⅰ，650~9 00 nm）和近紅外二區光（NIR-Ⅱ，900~1 700 nm）。NIR-Ⅱ相較NIR-Ⅰ具有更良好的組織穿透性，其本底熒光信號極低，分辨率較高，故有更好的應用前景［2］。NIR-Ⅱ成像的熒光納米探針包括有機小分子熒光探針（smallmolecule dye，SMD）、量子點（quantum dots，QDs）探針、稀土納米粒子（rare earth-doped nanoparticles，RENPs）探針、單筆納米碳管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）探針等［3］。各類探針具有各自的特點及優勢，SMD 在網狀內皮系統中攝取較少，有較好的臨床應用前景，腫瘤細胞示蹤多使用此類型探針；量子點相對分子質量小且因量子產率高（>10%），熒光信號佳，現為研究熱點［4］。隨著影像學的發展，生物成像的分辨率與疾病診斷能力逐漸上升，但傳統的X 線、CT、MRI 等均用于記錄生物體某一時刻的斷層成像，在動態觀測方面尚有欠缺［5］，而NIR-Ⅱ光因有望彌補上述不足，近年來被用于生物體活體動態成像技術，包括血管成像、神經成像、細胞示蹤成像等［6］。

細胞作為各器官發揮功能的基本單位，其運動在許多生理及病理生理過程中起著關鍵作用，如免疫監督、組織修復等［7］。探究生物體內細胞運動有助于更好地理解疾病的發生機制、演變過程、不同治療方法的療效及其機制。近年來發展迅速的免疫治療、再生醫學治療等均需監測治療用細胞的運動軌跡，確認是否定位準確并起到治療作用，確定最優給藥濃度及給藥時間［8］。最初的細胞示蹤主要通過觀察組織學切片，但生物體內存在復雜的內環境調節機制，而組織切片無法表現動態過程［9］。改良的細胞示蹤方法結合了傳統的成像方法，如CT、正電子發射斷層成像技術（positron emission tomography，PET）等，主要利用納米粒子如納米銅、18F-FDG（18F-flurodeoxyglucose）等標記細胞進行成像，而這些方法因仍無法動態成像、對部分細胞的標記困難、放射性污染等原因限制了其應用［10］。被廣泛應用的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記法因組織穿透性低且本底熒光高而限制了其在活體組織成像中的應用［11］。NIR-Ⅱ熒光成像彌補了上述不足，無放射性危險且細胞毒性較小，擁有高組織穿透性及極低本底熒光，故此項技術以活體動態成像作為最大的亮點及優勢［1］，在細胞示蹤技術上有巨大的應用潛力。

NIR-Ⅱ熒光成像的應用研究正逐步多樣化，但其在活體細胞示蹤上的應用作為醫學進入 “精準化” 后的一個新興領域，尚處于初步研究階段。近年來開展了許多細胞示蹤的研究，但尚缺乏對此類研究的總結，故本文主要對于近紅外二區熒光成像在腫瘤細胞、干細胞等不同細胞示蹤中的應用進行綜述，并對未來研究進行展望。

腫瘤細胞腫瘤常年居于全球死亡病因首位［12］，而腫瘤細胞的轉移為關鍵性危險因素，包括血行轉移、淋巴轉移［13］等。現有影像學技術無法發現的手術后殘余病灶及各種轉移病灶影響腫瘤的治療效果及患者預后，故在微觀層面監測腫瘤細胞有迫切的需求。利用NIR-Ⅱ光的腫瘤細胞熒光成像不僅能在微觀層面追蹤腫瘤細胞，還能通過光熱效應殺滅腫瘤細胞［14］。

肝癌細胞 肝癌細胞的示蹤涉及基礎研究與臨床研究。基礎研究方面，Yan 等［15］構建的牛血清白 蛋 白CuS@BSA-RGD（bovine serum albumin，BSA）納米粒子靜脈注射后可定位至原位肝細胞癌病灶，其中精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸環可使粒子定位至肝癌細胞的整合素受體αvβ3/αvβ5，其在NIR-Ⅱ光下有較強信號并在24 h 時達到頂峰。有研究將RGD 肽、吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）結合紅細胞，得到多模式化的紅細胞探針，通過靜脈注射進入體內后10 h 可以有效定位至皮下肝癌小鼠模型的腫瘤病灶，并實現NIR-Ⅱ成像指導的外科腫瘤與轉移淋巴結切除手術，病理結果證實在注射后10~13 h 內的切除效果良好［16］。而Hu 等［17］首次將NIR-Ⅱ成像技術用于臨床研究中，使用ICG 作為探針靜脈注射入23 例患者體內，平均4 天后進行開腹肝細胞癌病灶切除術。術中同時使用NIR-Ⅰ與NIR-Ⅱ成像技術進行輔助，通過病理學驗證。結果表明二者均可探測超聲與外科醫師未能發現的肝細胞癌原位病灶與轉移病灶，其中NIR-Ⅱ成像的敏感性更高，可發現被NIR-Ⅰ所忽略的病灶，且幾乎不受手術室內其他光源影響，進一步肯定了NIR-Ⅱ技術在臨床應用上的可能性與有效性。

乳腺癌細胞 有研究構建了多功能粒子命名為FIP-99mTc［18］，同時支持MRI 成像（含Fe3O4）、近紅外二區成像（含IR-1061 有機染料）、SPECT/CT 成像（含99 mTc）、光熱療法等多種成像和治療，且對細胞沒有明顯毒性。將此粒子注射入小鼠乳腺癌腫瘤病灶后，NIR-Ⅱ光照射下轉移的淋巴結病灶中可以發現熒光信號，并在2 h 時達到頂峰。不僅如此，此粒子在808 nm 治療激光的照射下可以通過光熱效應有效殺滅腫瘤細胞。但因無法保證所有腫瘤原病灶內細胞被標記，故存在一定的漏診率。另一種用于示蹤小鼠乳腺癌（4T1）細胞的方法為，使用腫瘤細胞膜（含CD47 抗原）包被Ag2Te 量子點，注射后24 h 腫瘤病灶內的信號（1 300 nm）可達頂峰［19］。 噻吩并［3，4-B］噻吩（Thieno［3，4-b］thiophene，TT）連接復數噻吩鏈得出的TT-3T CP也可以用于標記該細胞，在細胞與探針共培養后12 h 熒光信號達到最高。研究中通過體外標記乳腺癌細胞后注射入小鼠皮下實現體內示蹤，癌細胞熒光信號可在皮下持續存在至注射后10 天［20］。但因探針在體內標記乳腺癌細胞的效果未得到實驗證實，缺乏臨床意義，此探針更適合用于靜脈注射后的微血管成像及淋巴結成像。而對于人乳腺癌細胞展開的研究較少，僅體外細胞實驗證明，可以使用修飾后的Ag2S 量子點［21］或人工合成的聚合物pDA［22］連接西妥昔單抗，去結合細胞表面的表皮生長 因 子 受 體（epidermal growth factor receptor，EGFR）達到示蹤目的，但EGFR 的特異性不強等原因限制了其應用。

人宮頸癌細胞（HeLa 細胞） 靜脈注射的粒子如何定位到腫瘤細胞是一個難題，而HeLa 細胞作為擁有強大繁殖能力的腫瘤細胞株，被廣泛用于研究。Wei 等［23］在HeLa 細胞模型小鼠中使用透明質酸（hyaluronic acid，HA）作為配體，將其連接到噻吩與異靛藍衍生物結合的聚合物，形成納米粒子，此粒子可以在靜脈中隨血液循環，結合到HeLa 細胞高表達的HA 受體CD44，從而定位腫瘤病灶，且1 064 nm 波長NIR-Ⅱ光下可使局部溫度達到60.3 ℃。HA 受體并非HeLa 細胞特有，其具有被用到其他腫瘤細胞追蹤的可能性。同時，有研究通過靶向線粒體，實現了NIR-Ⅱ光下腫瘤病灶的可視化。被命名為T-IPIC 的納米粒子（nanoparticles，NPs）含有可定位至線粒體的三苯基鏻（triphenylphosphonium，TPP），靜脈注射48 h 后在腫瘤部位高表達，并維持較高信號至96 h。該粒子在（1 000±10）nm 光照范圍下有良好的成像功能，在808 nm 光下有最佳的光熱效應和光動力學效應［24］。葉酸（folic acid，FA）作為HeLa 細胞靶向配體的有效性也得到了實驗證明。Jeong 等［25］將 聚 合 物 包 被 的PbS/CdS core/shell 量子點與葉酸進行連接，構建FA-PQDs（1 280 nm）和普通PQDs（1 080 nm），并比較了腫瘤病灶內二者聚集性的差異，結果提示FA-PQDs 在腫瘤成像方面有更高的信噪比，且FA 可以幫助量子點定位至腫瘤。

結腸癌細胞 腫瘤細胞所表達的受體常被用于免疫治療靶點，其中PD-L1 表達于多種腫瘤細胞，而其單抗的使用也已非常成熟［26］，故高表達PDL1 的腫瘤細胞可以使用NIR-Ⅱ成像技術進行示蹤。Wan 等［27］在小鼠結腸癌細胞（MC38）模型中將PD-L1 的抗體連接到IR-BGP6 熒光團，形成PD-L1-BGP6，靜脈注射后24 h 在腫瘤病灶達到信號頂峰（1 200 nm），并在10 天內通過腎臟快速排泄。此方法在活體狀態下比較PD-L1 表達量的差異，監測了PD-L1 單抗治療腫瘤的效果。因PD-L1 在其他腫瘤細胞中也有較多表達，有望被用于MC38 結腸癌細胞之外的其他腫瘤細胞的標記。有研究使用了新合成肽介導的CP?IRP 納米探針，靶向結合腫瘤細胞高表達分子CD133，能夠活體標記并觀察人結腸癌細胞。該探針在6 h 內腎臟去除率達80%，具有較高的安全性，也可以對尿道進行直觀的顯像。

其他癌細胞 有研究構建了肽類化合物DUPAaFFC 作為可特異性識別前列腺癌細胞膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）的探針，連接到熒光納米粒子后結合NIR-Ⅱ光和電感耦合等離子體質譜，用于監測血液中是否含有過量PSMA 及表達PSMA 的細胞數目［28］。結合GD2 抗體，金納米粒子（gold nanoparticle，GNP）的納米碳管（single-wall carbon nanotube，SWCNT）可作為探針有效標記黑色素瘤細胞，在1 100 nm NIR-Ⅱ光下能夠進行雙光子顯像觀察腫瘤病灶，體外實驗證明在980 nm 光激發下實現了100%的黑色素細胞殺傷率［29］。另外，有些探針可以用于標記多種腫瘤細胞，CD44 在胰腺癌、乳腺癌、腦膠質瘤細胞中均有表達，利用P-選擇素作為配體構建的BLIPO-1048 擁有結合至CD44 受體的能力，可以標記上述細胞且不會被巨噬細胞快速清除，1 064 nm 光下通過光聲成像可直觀觀察腫瘤病灶［30］，同時具有光熱效應。

干細胞干細胞為具有多向分化功能的細胞，使用干細胞的細胞治療法有望成為治療許多疾病的有力手段，包括肝臟疾病、心血管疾病、神經系統疾病、腎臟疾病、杜氏肌營養不良等，而移植或注射后干細胞的運動須嚴密監測，以確定其具體療效、最優劑量及潛在風險等［31］。

內皮祖細胞 內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作為能自我更新、增殖分化為內皮細胞的多能干細胞，被用于治療組織缺血性疾病，其可通過分化為成熟的內皮細胞，促進缺血組織的血管再生［32］。Lim 等［33］使用共軛二苯并環辛炔（DBCOCy5）對EPCs 進行標記后局部注射到后肢血管損傷模型小鼠的病灶以觀察細胞對血管再生的影響。標記完成的細胞具有良好的原始功能，使用熒光分子斷層成像技術（fluorescence molecular tomography，FMT）與多普勒激光可以直觀地觀察到EPCs 的去向、滯留時間及血管新生，為使用干細胞治療缺血性疾病提供了有效的監測方法。

間充質干細胞 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）為目前臨床中研究最多的一類干細胞，被用于各類免疫性疾病、心力衰竭、克羅恩病導致的腸瘺等疾病的治療［34］，而治療用MSCs 的體內監測對細胞治療法有重大意義。使用PbS 量子點標記MSCs（峰值1 300 nm），局部注射至岡上肌損傷小鼠模型的關節腔內，在NIR-Ⅱ光下可以動態觀察到細胞在損傷部位的聚集、滯留時間、排出時間及排出途徑等［35］，研究表明關節腔注射后干細胞會逐步移動到損傷部位肩袖足印處，這可以為探究MSCs 治療機制及優化細胞療法提供有力的工具。

有研究提出了使用有機半導體聚合物納米探針（organic semiconducting polymer-based nanoprobe，OSPNs+）示蹤人MSCs 的方法，將標記的細胞分別注射入小鼠皮下和顱內，1 064 nm NIR-Ⅱ下的成像結果比傳統NIR-Ⅰ光成像具有更好的顯像功能，且通過光聲成像可以更直觀地觀察到細胞的分布位置［36］，但暫未進行細胞治療作用的研究。MSCs 還被應用于皮膚創傷的修復。Chen 等［37］使用Ag2S 量子點標記MSCs，探究其修復皮膚創面情況，靜脈注射后MSCs 絕大部分聚集于肺及肝臟，12 h 后逐漸聚集到創口邊緣，當創面添加基底細胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1a，SDF-1a）后4 h 細胞即開始聚集到創口邊緣，并發揮修復作用。

肌源性干細胞 鐵酸鉍諧波納米顆粒（bismuth ferrite harmonic nanoparticles，BFO HNPs）可被用于標記肌源性干細胞（muscle-derived stem cells，MDSCs），體外細胞實驗表明其未對細胞的性能及形態產生影響，且具有較高信噪比，但細胞的聚集性有所下降。標記的細胞在局部肌肉注射后24 h仍存留在肌肉中［38］，有望用于治療杜氏肌營養不良，但具體治療效果及機制有待在疾病動物模型中進一步探究，盡管使用的激發光是1 300 nm NIR-Ⅱ光，其肌肉組織穿透深度1 mm 的特性在一定程度上限制了活體成像應用。

其他細胞除上述大類外，還有NIR-Ⅱ熒光成像示蹤若干不同種類細胞的報道，反映該技術對多種細胞均適用，有強大的潛在應用價值。

免疫細胞 免疫細胞作為人體中承擔防御，監測及殺傷工作的重要細胞，其功能的正常發揮對于機體有重要作用，故對細胞運動有實時監測的必要性。目前NIR-Ⅱ熒光成像在免疫細胞中的研究主要集中在其對腫瘤性疾病的治療作用。通過使用Ag2Se（λ=1 350 nm）量子點標記自然殺傷（natural killer，NK）細胞，可在波長1 050 nm 的NIR-Ⅱ光照下顯示NK 細胞的分布情況。注射NK 細胞前通過Ag2S（λ=1 050 nm）標記NK 細胞的趨化因子及化療藥物，提前靜脈輸送至腫瘤病灶可顯著提高NK 細胞定位腫瘤的效率［39］。除NK 細胞外，Yu 等［40］通過近乎無創的方法監測了體內骨髓來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的分布。通過使用兩種非重合波長的NIR-Ⅱ（NIR-Ⅱa 和NIR-Ⅱb）量子點探針分別包被MDSCs 的兩種標志性抗體，尾靜脈注射入體內后利用兩種NIR-Ⅱ光影像的重疊精準描繪了MDSCs 在小鼠體內和腫瘤中的分布，同時可比較治療前后MDSCs 的量及分布情況。研究表明腫瘤微環境內MDSCs 越少，免疫檢查點阻斷治療的效果越好［41］，這對提高免疫檢查點阻斷法治療腫瘤的有效性有重大意義。

卵巢顆粒細胞 卵巢顆粒細胞等生殖腺內細胞可利用受體與配體結合的原理來進行NIR-Ⅱ光下示蹤。為研究促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）的受體細胞，Feng 等［42］使用熒光探針CH1055 標記FSH，通過尾靜脈注射定位至小鼠卵巢與睪丸中擁有FSH 受體的細胞，共聚焦熒光顯微鏡下可以獲得精準的影像。除此之外，也可以通過此項方法無創定位破骨細胞［43］。

成纖維細胞 Yang 等［44］提出過較為簡便的、基于Ag2Te的一站式探針合成方法，粒子發射光波長為995~1 068 nm，有較小表面涂層厚度（1.5~1.9 nm）。Ag2Te 量子點具有較高光穩定性、膠體穩定性和極低的細胞毒性，能夠有效標記小鼠成纖維細胞。但此項技術僅有體外細胞實驗的證據，有待進一步體內實驗的確認。

結語NIR-Ⅱ熒光成像以活體動態成像作為最大的優點及特點，在細胞示蹤技術上的應用目前集中于腫瘤細胞與干細胞，使用量子點、有機納米粒子等對細胞進行標記后，通過局部或靜脈注射入體內，而靜脈注射途徑通常使用粒子包被細胞特異性抗體的方法進行靶向定位。NIR-Ⅱ熒光成像有巨大的應用潛力，同時有一定的不足，實際應用還需進一步探究。

首先，NIR-Ⅱ成像技術本身具有進一步提升的需求與可能性，包括熒光探針的優化和分辨率的提高。探針的優化需要熒光強度和特異性的提升，故進一步研究可致力于研發具有高熒光性能與低生物毒性的新材料，并對目前材料進行修飾，從而提高探針的靶向性能。在分辨率方面，目前的NIR-Ⅱ熒光成像技術雖可以示蹤細胞，但未達到真正的微觀成像。通過結合顯微層面上的成像技術、改善發光材料的性能、提高細胞與材料的結合方式等方法，可提高成像的分辨率。其次，NIR-Ⅱ熒光成像技術示蹤細胞的應用領域有待開拓與豐富，將其應用于更多種類的細胞。此技術有臨床應用的先例，可積極向臨床應用方向進行探索。在目前最受關注的腫瘤應用方面，可進一步探究其輔助外科手術的可行性，而鑒于目前所用為非特異性探針，臨床應用中可探究不同探針的靈敏度與特異性，尋找各類疾病中最適合使用的探針。另外，在細胞治療與組織工程方面也有進一步拓展應用的必要性。各類細胞治療的體內監測相關研究有助于優化治療劑量、治療時間窗。而近年來附有生長因子及MSCs 的生物支架、人工韌帶等組織工程生物材料在醫學領域中受到關注，雖然其有效性通過組織學得到了認證，但是具體治療機制不詳，影響了實際臨床應用及產品化，故可在NIR-Ⅱ光下探究上述材料所負載干細胞的具體移動路徑及其治療作用，幫助優化一系列人工器官替代產品的設計理念和方法。

作者貢獻聲明李惠珠 論文構思和撰寫。陳俊 論文構思和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。