運用網絡藥理學方法探討安胃二號方治療胃癌前病變的作用機制

吳月霞，蒙毅，龔純，朱永蘋，林壽寧，許裕偉，康雪瑩

作者單位：1廣西中醫藥大學研究生院，廣西壯族自治區 南寧 530001；2廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院消化內科，廣西壯族自治區 南寧 530011

胃癌前病變（gastric precancerous lesions，GPL）是在慢性胃炎的基礎上伴發上皮內瘤變的胃黏膜病理組織學變化。上皮內瘤變作為重要的癌前病變，主要表現為上皮結構改變和細胞學異常，屬于浸潤前的腫瘤性改變［1-2］。幽門螺桿菌（Helico?bacter pylori，Hp）感染是導致胃癌前病變的重要因素，可通過炎性刺激、誘導基因突變等機制致胃上皮細胞出現增殖損傷，使細胞結構及基因表達水平發生改變［3］。流行病學研究［4］顯示我國胃癌的發病率及病死率在全國惡性腫瘤中高居第二位，因此對胃癌前病變進行及時有效地干預治療，阻止甚至逆轉慢性胃炎向胃癌前病變發展，是防治胃癌的關鍵。

安胃二號方是全國名老中醫林壽寧教授根據胃癌前病變濕邪郁阻，氣血澀滯，胃氣不和的基本病機［5］創制的臨床有效經驗方，由蒼術、半夏、陳皮、茯苓、薏苡仁、草果、三七7 種中藥組成。前期研究發現安胃二號方可明顯改善胃癌前病變病人臨床癥狀及病灶組織病變情況，提高Hp 根除率［6］；另有研究發現安胃二號方能增加慢性萎縮性胃炎病人胃黏膜TFF1 蛋白表達，在促進胃黏膜修復和細胞分化、抑制細胞增殖等方面發揮重要作用［7］；實驗研究運用安胃二號方干預胃潰瘍大鼠模型，發現安胃二號方能明顯抑制胃黏膜組織中核因子（NF）-κB 蛋白活化，通過調控炎性介質、趨化因子和炎性相關酶的過度表達，達到抑制炎癥細胞浸潤、減輕炎癥反應的作用［8］。本研究將運用網絡藥理學方法，分析安胃二號方對慢性胃炎向胃癌前病變進展過程中相關基因水平的調控，為開展安胃二號方治療胃癌前病變的研究提供可參考的理論依據。

1 材料與方法

1.1 安胃二號方的有效化合物及靶點的篩選本研究起止時間為2020 年2—3 月。運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），篩選安胃二號方中符合口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 的有效化合物，并通過DrugBank 數據庫（https：//www.drugbank.ca/）進行靶點注釋。

1.2 胃癌前病變相關基因的篩選經GEO 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），以“gastric precan?cerous lesions”為關鍵詞搜索胃癌前病變及慢性胃炎的相關表達基因，選擇GSE55696 數據進行挖掘分析。篩選該數據中的19 例慢性胃炎樣本作為慢性胃炎基因組（樣本號GSM1341860～1341878），并整合該數據中的19 例低級別上皮內瘤變及20 例高級別上皮內瘤變作為胃癌前病變基因組（樣本號GSM1341879～1341917），以P<0.05 且|logFC|>1 為標準篩選胃癌前病變與慢性胃炎的差異表達基因，并構建基因差異熱圖。

1.3 安胃二號方治療胃癌前病變的作用靶點及化合物網絡構建在Venny中導入安胃二號方的有效靶點及胃癌前病變的差異基因，篩選出的交集基因即為作用靶點，并篩選出安胃二號方治療胃癌前病變的作用化合物。在Cytoscape 導入作用靶點和化合物，設置節點表示作用化合物及靶點，以邊表示連接關系，進行網絡構建。

1.4 作用靶點的蛋白質相互作用網絡構建在String 數據庫（http：//string-db.org）導入安胃二號方治療胃癌前病變的作用靶點，設定物種“homo sapi?ens”，構建蛋白質相互作用網絡圖，獲取蛋白互作信息，篩選關鍵基因。

1.5 安胃二號方治療胃癌前病變的GO 富集分析使用DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），對安胃二號方治療胃癌前病變參與調節的具有顯著變化的生物過程和細胞成分進行分析。

1.6 安胃二號方治療胃癌前病變的KEGG 富集分析運用京都基因與基因組百科全書數據庫（https：//www.kegg.jp/），對安胃二號方治療胃癌前病變參與調控的通路及基因進行分析。

2 結果

2.1 安胃二號方的有效化合物及靶點通過篩選共獲得安胃二號方的57種有效化合物，分別是蒼術9 種、半夏13 種、陳皮5 種、茯苓15 種、薏苡仁9 種、草果8 種、三七8 種，其中多種中藥具有相同種類的化合物。對所得化合物進行基因注釋，得到233 個有效靶點。

2.2 胃癌前病變的相關基因將整理得到的慢性胃炎基因組和胃癌前病變基因組進行數據分析，根據P<0.05 且|logFC|>1 篩選得到1 699 個差異表達基因，其中上調基因785 個，下調基因914 個。選擇|logFC|數值大小在前20 個的上調基因及下調基因進行可視化分析。

2.3 安胃二號方治療胃癌前病變的作用靶點及化合物網絡運用Venny 軟件將安胃二號方的233 個靶基因與胃癌前病變的1 699 個差異基因進行取交集，得到安胃二號方治療胃癌前病變的31個作用靶基因，并篩選出安胃二號方治療胃癌前病變的23個作用化合物。通過Cytoscape 構建安胃二號方治療胃癌前病變的作用網絡，包含54 個節點和81 個邊緣，表示7味中藥的23個化合物與31個基因共有81個作用關系。

2.4 作用靶點的蛋白質相互作用網絡將31 個作用靶點導入String 數據庫，得到靶基因所編碼的蛋白質之間相互作用的網絡，包含31 個節點和69 條邊，平均節點度為4.45，根據節點度數選擇前數值大小在前20個的蛋白進行條形排列，其中前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、白細胞介素（IL）-6、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、基質金屬蛋白酶3（MMP3）、炎性趨化因子2（CXCL2）等14個蛋白的作用度值在平均節點度以上，節點度數越大表示蛋白互作關系越多。

2.5 安胃二號方治療胃癌前病變的GO 富集分析安胃二號方治療胃癌前病變的31 個作用靶基因富集于對細菌來源分子的反應、對脂多糖的反應、細胞氧化應激反應、多細胞組織內穩態、外部刺激反應的正向調節、血管內皮生長因子的調控等342 個生物過程；作用于突觸膜、受體復合體、膜筏、膜區、內質網內腔、細胞-細胞連接等19 個細胞。選擇具有顯著差異的條目進行可視化分析。

2.6 安胃二號方治療胃癌前病變的KEGG 富集分析作用靶點主要富集于IL-17 信號通路（hsa04657：PTGS2、FOSL1、IL6、MMP3、CXCL2、MAPK3）、HIF-1 信號通路（hsa04066：NOS2、IL6、HMOX1、SERPINE1、MAPK3）、腫瘤壞死因子信號途徑（hsa04668：PTGS2、IL6、MMP3、CXCL2、MAPK3）、VEGF 信 號 通 路（hsa04370：PTGS2、HSPB1、MAPK3）。根據通路與靶點之間的聯系，運用Cyto?scape軟件構建基因通路網絡。

3 討論

中醫藥通過辨證論治與臨床實踐經驗結合的特點，運用多味中藥配制成中藥復方治療疾病，通過協同作用提高治療效果。本研究通過網絡藥理學方法得到安胃二號方的57 個有效化合物及233個有效靶點，其中有23 個化合物及31 個靶點作用于胃癌前病變的治療過程，調節342個生物過程、19個細胞成分及4條主要信號通路，具有多成分、多靶點、多途徑的特點。

安胃二號方治療胃癌前病變的作用靶點中，PTGS2、IL6、MAPK3、MMP3、CXCL2 等與其他靶點的聯系數量均在平均節點度以上，并且還參與調控IL-17 信號通路、HIF-1 信 號通路、TNF 信號途徑、VEGF 信號通路中的多條信號通路，這些通路均與細胞炎性反應、細胞增殖及凋亡相關，這與GO 富集結果一致，因此推測以上靶點可能是安胃二號方治療胃癌前病變所調控的關鍵靶點。其中PTGS2 與安胃二號方中的6 種中藥的21 個化合物相關，與9個作用靶點相互作用，且與以上關鍵靶點均有聯系，還參與調控IL-17 信號通路、TNF 信號通路、VEGF 信號通路，在胃癌前病變的治療過程中發揮重要作用。

PTGS2又稱環氧化酶2（COX-2），是前列腺素合成的重要限速酶，正常生理狀態下呈低表達狀態，在炎癥因子、促癌劑等病理因素誘導下可迅速合成呈表達升高趨勢，在腫瘤組織炎癥微環境中起著關鍵作用［9］。目前研究已證實COX-2的過度表達可通過多種方式促進炎癥進展和腫瘤增殖、侵襲及轉移。單輝國等［10］通過對慢性胃炎、胃癌前病變、胃癌病人胃黏膜免疫組化檢測發現COX-2 的表達水平與病變程度呈正相關，且胃癌前病變及胃癌病人COX-2 表達陽性率與Hp 感染后的炎性刺激明顯相關；張英輝等［11］發現COX-2 和VEGF 蛋白表達在慢性胃炎、胃癌前病變、胃癌病人胃黏膜中呈逐漸上升趨勢，且COX-2的過表達可誘導VEGF 表達升高，促進腫瘤血管生成；劉金狄等［12］運用中藥干預胃癌前病變大鼠模型發現下調大鼠胃黏膜NF-κB 及COX-2 表達水平可促進胃黏膜上皮細胞凋亡、抑制細胞增殖。

IL6 參與調節機體免疫應答和炎癥反應，可通過IL6 的過表達參與腫瘤細胞增殖［13］。唐菁等［14］運用COX-2 抑制劑干預人胃癌細胞模型，發現癌細胞中COX-2 及IL-6 表達水平明顯降低，細胞增殖明顯受限。MAPK3 在磷酸化激活后參與從細胞骨架變化到基因轉錄的各種細胞反應，對細胞周期和信號轉導有調控作用，在抑制細胞增殖分化、誘導免疫應答及穩定細胞形態等方面發揮著重要作用［15］。Oyeniran、Tanfin［16］研究發現抑制COX-2 及MAPK3/1通路可改變MAPK 的聯級反應，控制細胞炎性反應及增殖轉移。MMP3能降解細胞外基質中的蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，重塑細胞外基質的動態平衡，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵作用［17］。封慧等［18］發現胃癌前病變大鼠胃黏膜中COX-2 及前列腺素E2 的高表達可誘導MMP3 的生成和活化，通過破壞細胞基底膜，促進腫瘤細胞浸潤及轉移。CXCL2 是一種原癌基因編碼的蛋白，可趨化中性粒細胞遷移加重炎癥反應，可促進腫瘤新生血管生成［19］。有研究發現CXCL2 表達在胃炎和胃癌中均有上調，且可能與COX-2 高表達誘導PGE2合成增多途徑有關［10］。

安胃二號方治療胃癌前病變的作用靶點在IL-17 信號通路中富集最多，分別是PTGS2、FOSL1、IL6、MMP3、CXCL2、MAPK3，除FOSL1 外這些基因同時也參與對TNF 信號通路的調節。IL-17 信號通路與炎癥反應相關，當IL-17 結合于靶細胞后可促進炎性因子表達，引起慢性炎癥、組織增生及腫瘤新生血管生成［20］。TNF 信號通路參與胃癌發生發展的全過程，對炎癥反應發生及腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移均有調控作用［21］。因此推測安胃二號方治療胃癌前病變參與調節IL-17 信號通路和TNF 信號通路可能通過上調MAPK3 表達、下調FOS 樣抗原-1（FOSL1）及MMP3 表達，以保持細胞外基質的動態平衡，減少炎性因子對胃上皮細胞的損傷，抑制腫瘤的增殖、侵襲及轉移，促進信號轉導和細胞周期的正向調控；并且通過下調炎性因子IL6、PTGS2 及趨化因子CXCL2 水平，調節免疫應答能力，減少炎癥反應對胃黏膜的損傷，阻止腫瘤細胞的增殖。

此外，安胃二號方對胃癌前病變的治療還可通過調節NOS2、IL6、HMOX1、SERPINE1、MAPK3的表達水平調控HIF-1（缺氧誘導因子）信號通路。腫瘤細胞的過度增殖可致血液供應不足形成低氧環境，同時腫瘤因子的刺激可使局部血管通透性增強致大量免疫細胞聚集引起細胞缺氧，加重對胃黏膜的損傷。黃柳向等［22］發現胃癌前病變大鼠胃黏膜中HIF-1ɑ、VEGF 呈高表達狀態且隨病變程度增強，而通過中藥進行干預治療后發現下調HIF-1ɑ、VEGF表達可有效逆轉胃癌前病變。因此推測其作用機制可能是通過MAPK3 及下調纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）的表達，改變細胞基質的重塑功能，誘導免疫應答，阻止腫瘤細胞增殖侵襲；通過下調IL6 等炎性因子水平、下調一氧化氮合酶2（NOS2）及血紅素加氧酶1（HMOX1）等血管相關基因表達，減輕對胃黏膜上皮細胞及血管的損傷，使病變細胞處于缺血缺氧狀態。

VEGF 信號通路參與對血管形態和功能的調控，可誘導腫瘤血管生成，對腫瘤的發生和轉移起重要作用。Lee 等［23］發現VEGF 介導的HSPB1 磷酸化可抑制HSPB1 分泌及結合活性，并通過對小鼠胃癌模型的觀察發現腫瘤細胞可降低HSPB1 的分泌，促進腫瘤新生血管生成。安胃二號方治療胃癌前病變可通過影響PTGS2、HSPB1、MAPK3 水平參與調節VEGF 信號通路，因此推測其可能通過上調MAPK3 水平、下調PTGS2 表達以減輕炎性刺激，誘導免疫應答；通過抑制HSPB1（熱休克蛋白B1）磷酸化，使HSPB1 水平上調，發揮抑制腫瘤血管生成作用。

本研究采用網絡藥理學方法探討安胃二號方治療胃癌前病變的作用機制，推測安胃二號方可能通過影響PTGS2、IL6、MAPK3、MMP3、CXCL2 等基因的表達水平，參與對IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號途徑、VEGF 信號通路的調控，通過改變細胞結構及相關生物過程，減輕胃黏膜炎癥損傷，促進胃黏膜細胞形態及功能恢復，抑制細胞增殖侵襲，阻止甚至逆轉胃黏膜慢性炎癥向胃癌前病變發展，達到治療胃癌前病變的目的。本研究結果將為開展安胃二號方治療胃癌前病變的研究提供可參考的理論依據。