散瘀止痛續(xù)骨方通過Wnt3a/Lrp5信號(hào)通路促進(jìn)肱骨骨折大鼠骨愈合

張永占，張寧，尚紅濤，劉子豪，王燚煒

（1.秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島 066600；2.衡水市人民醫(yī)院，河北衡水 053000）

肱骨骨折是由車禍、擠壓、手或肘部直接接觸地面等直接或間接暴力所導(dǎo)致的一種骨科常見疾病[1]。該病致傷原因復(fù)雜，極易伴隨血管及神經(jīng)等損傷，且骨折愈合本身是一個(gè)復(fù)雜且相對漫長的生物學(xué)過程，臨床常見骨折延遲愈合或不愈合[2]。因此，如何縮短骨折愈合時(shí)間、促進(jìn)骨折愈合、減少骨折延遲愈合及不愈合等情況一直是骨科亟待解決的問題。中醫(yī)學(xué)在加速促進(jìn)骨折愈合方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨折愈合是“瘀去、新生、骨合”循序漸進(jìn)的過程，即“血不活則瘀不能去，瘀不去則骨不能接”[3-5]。本院自制散瘀止痛續(xù)骨方，具有散瘀、接骨、止痛的功效，臨床治療骨折取得了良好的療效；但其具體作用機(jī)制尚不明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a/低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（low density lipoprotein receptor-associated protein 5，Lrp5）信號(hào)通路在骨形成中發(fā)揮著重要的作用，其可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞形成、抑制破骨細(xì)胞骨吸收促進(jìn)骨重建，有效改善骨損傷[6]。因此，本研究基于Wnt3a/Lrp5信號(hào)通路探討散瘀止痛續(xù)骨方對肱骨骨折大鼠的治療機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用治療骨折提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0018。大鼠單籠喂養(yǎng)，12 h/12 h晝夜交替，在常溫下無菌自由進(jìn)食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑與儀器 散瘀止痛續(xù)骨方由乳香8 g、沒藥8 g、地鱉蟲10 g、赤芍15 g、川芎10 g、桂枝8 g、延胡索10 g、木香8 g、枳殼6 g、羌活6 g、防風(fēng)6 g、骨碎補(bǔ)12 g、續(xù)斷12 g、澤瀉10 g、車前子8 g、白術(shù)10 g、熟地6 g、當(dāng)歸6 g、黨參10 g、黃芪20 g、甘草6 g組成，所有中藥材均購自秦皇島市第一醫(yī)院中藥房。辛伐他汀片（北京伊塔生物科技有限公司，批號(hào)：YT1963）。生理鹽水（北京伊塔生物科技有限公司，批號(hào)：YT3740）；蘇木素染液（美國Sigma公司）；伊紅染液（上海吉至生化科技有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Wnt3a抗體（艾美捷科技有限公司）；Lrp5抗體（武漢菲恩生物科技有限公司）；GAPDH抗體（美國Proteintech公司）。克氏針（河南澤垣醫(yī)療器械銷售有限公司）；骨鉗（南京卡爾文生物科技有限公司）；CX-60光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；KUBTEC XRAY-DXA雙能X線骨密度儀[博卓生物科技（上海）有限公司]；KW-GU小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測定儀（南京卡爾文生物科技有限公司）。

1.3 分組、造模與給藥 將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組，每組10只。模型組、辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組大鼠構(gòu)建肱骨骨折模型。方法：麻醉大鼠后，將其仰臥位固定，消毒后充分暴露出肱骨骨干及肱骨內(nèi)外髁，將1 mm克氏針逆行向上鉆入肱骨髓腔，穿出皮膚后剪除多余針頭尾端，用骨鉗截?cái)嚯殴巧?/3處以造成橫行骨折。活力碘沖洗后在骨折周圍滴入慶大霉素3滴，逐層縫合傷口，術(shù)畢給予肌肉注射50 mg/kg青霉素，連續(xù)3 d。正常組不做任何處理。建模成功后，散瘀止痛續(xù)骨方組給予灌胃1.5 mg·kg-1·d-1散瘀止痛續(xù)骨方水煎液（按中藥常規(guī)煎煮方法），辛伐他汀組給予20.0 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃，正常組、模型組同期給予同體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)21 d。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 X線攝片 給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，固定，對患肢行X線攝片檢查，觀察大鼠骨折的愈合情況。

1.4.2 大鼠肱骨骨密度測定 應(yīng)用雙能X線骨密度儀測量肱骨整體骨密度（total bone mineral density，tBMD）、近端（近端上1/4）骨密度（proximal bone mineral density，pBMD）、中段（中1/2）骨密度（middle bone mineral density，mBMD）、遠(yuǎn)端（下1/4）骨密度（distal bone mineral density，dBMD）。

1.4.3 大鼠肱骨骨強(qiáng)度測定 應(yīng)用小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測定儀檢測大鼠肱骨骨強(qiáng)度。

1.4.4 蘇木素-伊紅染色法觀察大鼠肱骨組織病理形態(tài) 處死大鼠，迅速游離出肱骨，洗凈后，進(jìn)行脫鈣、梯度乙醇脫水、二甲苯透明2次處理，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。脫蠟后，進(jìn)行常規(guī)HE染色，梯度乙醇及二甲苯脫水，透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肱骨組織病理學(xué)改變。

1.4.5 Western Blot法檢測大鼠肱骨組織中Wnt3a/Lrp5蛋白表達(dá) 取肱骨組織清洗、剪碎，加入放射免疫吸附分析（RIPA）裂解液研磨成勻漿，在冰上充分裂解10 min后，4℃離心取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。沸水浴3 min并冷卻后，進(jìn)行電泳，再用半干法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇活化的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。胎牛血清封閉2 h，分別加入稀釋的Wnt3a、Lrp5、GAPDH等一抗（體積比1∶1 000）4℃搖床振蕩孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，加入稀釋的二抗（體積比1∶5 000）室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯影，曝光。應(yīng)用ImageJ軟件分析灰度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肱骨X線攝片結(jié)果比較 圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組可見明顯骨折線，僅有少量骨痂生長且排列疏松；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組骨折線逐漸消失，骨痂明顯增多且排列規(guī)則緊密，骨密度明顯升高，且散瘀止痛續(xù)骨方組較辛伐他汀組改善明顯。

圖1 各組大鼠肱骨X線片表現(xiàn)Figure 1 X-ray findings of humerus in each group of rats

2.2 各組大鼠肱骨骨密度比較 表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組各段肱骨骨密度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組各段肱骨骨密度顯著升高（P＜0.05），且散瘀止痛續(xù)骨方組升高作用優(yōu)于辛伐他汀組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肱骨骨密度比較Table 1 Comparison of humeralbone mineraldensity among various groups of rats （±s，g·cm-2）

表1 各組大鼠肱骨骨密度比較Table 1 Comparison of humeralbone mineraldensity among various groups of rats （±s，g·cm-2）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與辛伐他汀組比較

組別正常組模型組辛伐他汀組散瘀止痛續(xù)骨方組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 tBMD 0.211±0.01 0.156±0.01①0.178±0.02①②0.199±0.02①②③12.300＜0.001 pBMD 0.213±0.02 0.154±0.01①0.176±0.01①②0.199±0.03①②③8.344＜0.001 mBMD 0.212±0.01 0.155±0.02①0.176±0.03①②0.198±0.01①②③8.061＜0.001 dBMD 0.211±0.03 0.155±0.02①0.177±0.02①②0.201±0.01①②③4.912＜0.001

2.3 各組大鼠肱骨骨強(qiáng)度比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組肱骨骨強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組肱骨骨強(qiáng)度均顯著升高（P＜0.05），且散瘀止痛續(xù)骨方組升高作用優(yōu)于辛伐他汀組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肱骨骨強(qiáng)度比較（±s）Figure 2 Comparison of humeral bone strength among various groups of rats（±s）

2.4 各組大鼠肱骨骨折部位病理組織學(xué)特征比較 圖3結(jié)果顯示：正常組大鼠肱骨組織形態(tài)完整，骨小梁致密，骨髓腔大小正常，且可見成骨細(xì)胞；模型組骨組織形態(tài)遭到破壞，骨外膜內(nèi)層明顯增厚，出現(xiàn)明顯充血現(xiàn)象，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤及少量纖維組織；辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組可見大量肉芽組織生長和新生毛細(xì)血管及軟骨組織等，并出現(xiàn)大量骨痂及纖維組織，同時(shí)可見大量成骨細(xì)胞增生活躍，骨小梁間的空隙逐漸被新骨充滿。

圖3 各組大鼠肱骨骨折部位病理組織學(xué)特征比較（HE染色，×400）Figure 3 Comparison of histopathologicalcharacteristics of humeralfracture sites among various groups of rats（by HE staining，×400）

2.5 各組大鼠肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達(dá)比較 圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組、散瘀止痛續(xù)骨方組肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且散瘀止痛續(xù)骨方組升高作用優(yōu)于辛伐他汀組（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達(dá)比較Figure 4 Comparison of protein expression of Wnt3a，Lrp5 among various groups of rats

3 討論

良好的血供是促使骨折愈合的首要條件[7-8]。本研究X線攝片結(jié)果顯示，散瘀止痛續(xù)骨方組大鼠骨折線逐漸消失，骨痂明顯增多且排列規(guī)則緊密。病理組織學(xué)特征結(jié)果顯示，散瘀止痛續(xù)骨方組大鼠肱骨骨折部位新生大量肉芽組織、毛細(xì)血管及軟骨組織，出現(xiàn)大量骨痂及纖維組織，同時(shí)可見大量成骨細(xì)胞增生，骨小梁間的空隙被新骨充滿。表明散瘀止痛續(xù)骨方可顯著促進(jìn)骨折愈合，對肱骨骨折大鼠具有顯著的療效。提示散瘀止痛續(xù)骨方可能通過活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、祛瘀生新等功效，起到擴(kuò)張血管及促進(jìn)血管生成的作用，進(jìn)而有效改善血液循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體清除血腫的能力、增強(qiáng)血供，從而達(dá)到改善軟組織損傷、抑制骨吸收，促進(jìn)骨折的成骨等目的，最終有效促進(jìn)骨折愈合。

骨密度及骨強(qiáng)度是反映骨質(zhì)量及預(yù)測骨折危險(xiǎn)性的2項(xiàng)重要指標(biāo)，同時(shí)也與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性密切相關(guān)，其在判斷及研究骨骼生理、病理及診斷全身各種疾病等方面均占有重要地位[9]。提高骨質(zhì)量及骨的生物力學(xué)性能是骨折治療的主要作用機(jī)制[10]。本研究結(jié)果表明，散瘀止痛續(xù)骨方可顯著提高肱骨骨折大鼠骨密度及骨強(qiáng)度。提示散瘀止痛續(xù)骨方可能通過生新續(xù)損、接骨續(xù)筋等功效來促進(jìn)骨吸收與骨形成之間的偶聯(lián)作用，促進(jìn)骨痂形成，進(jìn)而有效促進(jìn)骨形成及骨重建，并改善骨生物力學(xué)。

骨骼的生長、發(fā)育和代謝需要骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等相互協(xié)調(diào)作用，一旦其之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞就會(huì)導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)的異常，而骨折愈合過程就是恢復(fù)這一動(dòng)態(tài)平衡的過程。孫欣欣[11]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a/Lrp5信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖、分化兩方面影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而影響骨質(zhì)的形成。有研究表明，Wnt3a可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化來參與骨形成[12-13]，而Lrp5可作為Wnt蛋白的跨膜受體通過促進(jìn)成骨細(xì)胞功能來影響骨量的積累[14]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，散瘀止痛續(xù)骨方組肱骨組織Wnt3a、Lrp5蛋白表達(dá)顯著升高，表明散瘀止痛續(xù)骨方可有效激活Wnt3a、Lrp5信號(hào)通路。提示散瘀止痛續(xù)骨方可能是通過激活Wnt3a、Lrp5信號(hào)通路，進(jìn)而達(dá)到刺激骨細(xì)胞增殖分化、增加成骨細(xì)胞活性及膠原合成、抑制破骨細(xì)胞骨吸收、增加骨基質(zhì)等的目的，從而促進(jìn)骨折的愈合。

綜上所述，散瘀止痛續(xù)骨方可有效地促進(jìn)骨折大鼠骨愈合，其作用機(jī)制可能與激活Wnt3a/Lrp5信號(hào)通路有關(guān)，且療效作用優(yōu)于辛伐他汀。