實時熒光定量PCR 法與涂片法檢測結核分枝桿菌的效果對比

李曉霞

（濱州市中心醫院結核科 山東 濱州 251700）

結核病是目前重點控制的傳染疾病之一，是全球需要面對的重要公共衛生問題。結核分枝桿菌（mycobac teriumtu berculosis, MTB）是引起肺結核主要致病菌，MTB 細胞壁結構較為特殊，具有較強的耐藥性，能抵抗多種藥物，疾病治療時間長，易增加患者的治療負擔；且該病若未能得到有效診治，會侵犯機體全身器官，嚴重危害患者的身體健康以及生命安全[1-2]。因此需要加強對結核病的積極防治，一旦發現該疾病，盡早隔離并接受針對性治療能夠幫助患者遠離疾病痛苦。當前，痰培養、涂片法、分子生物學等檢測方法原理各不相同，其檢查結果也存在一定差異性[3-4]。細菌學檢查是發現傳染源的主要途徑和手段，其中涂片法與痰培養是既往常用的檢測方式，能夠發現病原菌活動特點，且操作簡單、易行，但培養耗時較長，且影響因素較多，再加上部分患者癥狀并不具有典型性特點，影像學表現特征不足，因此部分患者難以獲得早期確診，甚至還會有誤診、漏診情況發生，影響患者后續治療[5-6]。聚合酶聯反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術的應用為MTB 細菌學檢查提供了特異、敏感、簡單的檢查方法，能夠檢測到結核分枝桿菌脫氧核糖核酸，有利于疾病進一步確診[7]。本文旨在對比涂片檢測方法與實時熒光定量PCR 法（GeneXpert MTB/RIF）檢測MTB 和對結核的診斷效果，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年1 月—12 月濱州市中心醫院結核科三病區住院肺結核患者144 例，非結核患者41 例。結核患者中，男性106 例，女性38 例；年齡14 ～82 歲，平均年齡（53.26±10.32）歲。非結核患者中，男性31 例，女性10 例；年齡16 ～78 歲，平均年齡（51.67±9.06）歲；疾病類型：肺炎26 例，肺癌2 例，結節病4 例，哮喘3 例，肺泡蛋白沉積癥1 例，間質性肺病1 例，非結核分枝桿菌病1 例，支氣管擴張并感染3 例。符合《赫爾辛基宣言》要求。

納入標準：①肺結核患者應符合《肺結核診斷標準》（WS-288-2008），且存在咳嗽、咯血、盜汗等一系列表現癥狀；非結核患者不符結核診斷校準且不存在上述癥狀。②入院后完善個人信息電子檔案建立，病史資料完整；③患者無嚴重心腦血管疾病。排除標準：①病史資料不全者；②不配合檢測者。

1.2 方法

所有患者均在早中晚漱口后，在醫護人員指導下深咳，并將痰液裝入一次性痰液杯中，加蓋送檢。（1）涂片檢測法：用竹簽蘸取少量膿樣痰液標本，將其涂抹于載玻片右側中央位置，于自然環境中晾干，并進行加熱固定，行抗酸染色鏡檢。將石碳酸復紅染色液滴于載玻片上，蓋滿玻片后用微火固定，觀察到有蒸汽出現后停止，保持5 min，用蒸餾水進行水洗；用酸性酒精脫色1 min，流水自玻片一端輕緩沖洗，如脫色不徹底，可重復一次；滴加亞甲藍復染液，染色30 s，瀝去復染液，沖洗玻片，瀝水，將染色后的玻片置于玻片架上，自然晾干；滴加鏡油鏡檢觀察。（2）實時熒光定量PCR 法檢測：取2 ～4 mL 標本，加入2 ～3 倍樣本體積的消化液溶液液化振蕩20 次左右，靜置液化30 min 后，取2 mL樣本置入PCR 反應管，放入實時熒光定量PCR 儀器（美國Cepheid 公司生產）進入檢測，約2 h 后查看結果。

1.3 陽性結果判定及觀察指標

（1）檢驗陽性結果判定：涂片檢驗陽性結果判定：以顯微鏡下100 個視野中發現≥3 條抗酸桿菌為陽性，未觀察到或＜3 條抗酸桿菌為陰性；實時熒光定量PCR法陽性結果判定：以檢測值≥500 copies/mL 為陽性。（2）觀察指標：觀察兩種檢測方式的MTB 陽性率和診斷的靈敏度、特異度、準確度、陰性預測值、陽性預測值。

1.4 統計學方法

使用SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料采用（± s）表示，行t檢驗；計數資料用頻數（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 痰涂片檢查與實時熒光定量PCR 檢查MTB 陽性率比較

實時熒光定量PCR 法MTB 陽性率高于涂片檢測法，兩種檢測方法陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩種檢測方法MTB 陽性率比較

2.2 兩種檢測方法診斷結果，見表2

表2 兩種檢測方法診斷結果（例）

2.3 觀察兩種檢測方式的診斷效果比較

兩種檢測方式診斷效果相比，以臨床診斷為金標準，實施熒光定量PCR 法檢測診斷的靈敏度、特異度、準確度及陰性預測值均高于涂片法，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩種檢測方法診斷陽性預測值比較，差異無統計學差異（P＞0.05），見表3。

表3 兩種檢測方法診斷的效果比較（%）

3.討論

結核病是由MTB 引起的慢性傳染性疾病，其隨著生活環境改變、不合理用藥、不良生活方式等因素影響，發病率逐漸呈上升趨勢，給大眾身體健康以及社會安全帶來了許多負面影響，為此加強對該疾病的有效防治是控制疾病進一步傳播的關鍵[8]。病原學檢測方式是診斷結核病的重要方法之一，其中涂片法與培養法臨床應用較為廣泛，培養法具有較高的診斷確診率，通過專用培養器皿來觀察致病菌，但其培養周期較長，易受環境、溫度等因素影響，存在假陽性和假陰性情況；涂片法是結核分枝桿菌檢查中最常用的檢測手段，其簡單易行，對檢測人員檢驗操作水平要求不高，但痰液標本中不僅包含MTB，還包括其他非結核桿菌，其也會使抗酸染色，形成假陽性，且部分患者也有結核桿菌染色不明顯而漏診，檢測準確性未能得到有效保障，需要尋求另外一種檢測方法[9]。隨著科學技術的快速發展，結核病實驗室檢測技術也取得了進一步的發展，新技術的應用提高了結核病的診斷效率，如實時熒光定量PCR 法。

本文結果顯示，實時熒光定量PCR 法陽性率（60.00%）高于涂片檢測法（42.16%），差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組檢測方式診斷效果相比，實時熒光定量PCR 法檢測診斷的靈敏度、特異度、準確度及陰性預測值均高于涂片法，差異有統計學意義（P＜0.05）。充分肯定該檢測方法的診斷效果。實時熒光定量PCR 法通過檢測結核桿菌DNA 來判斷患者是否有MTB 感染情況，進而判斷患者是否患有結核病，其能提升MTB 早期檢出率的可能。實時熒光PCR 法是將熒光反應物加入PCR 反應體系中，通過監測熒光信號的累積，實現監測PCR 的進程，且還有助于擴張反應體系中熒光強度為依據定量分析特定DNA，能避免檢出過程中受污染、環境等因素影響，能提升檢測速度及敏感性，能減少假陽性結果出現[10]。該檢測方法能夠早期診斷MTB 菌血癥，防止繼發性MTB 病灶形成，且該檢測方法僅需2 ～4 h 便能夠有效檢測某些培養法難以實施病例，提高檢測敏感性。此外，該檢查方法可以擴張著色活菌，以此來判斷病灶良惡性。與普通PCR 方法相比，實時熒光定量PCR 法敏感度更高，由自動化儀器收集熒光信號，避免了檢驗人員肉眼判斷的主觀性，能提高檢測結果準確性；且全封閉反應，無需PCR 后處理，保證了檢驗結果的可靠與可重復性；另外在線實時檢測熒光，檢驗結果客觀且直觀，無需接觸有毒試劑，操作安全，省時高效；因此該檢測方式適應范圍更廣，具有較高的應用價值。既往研究表明，實時熒光定量PCR 法對MTB 耐藥性有一定的檢測價值，能夠為臨床合理用藥提供指導[11]。另有研究表明，應用實時熒光定量PCR 法能夠有效分析和觀察MTB 感染發生通路，能夠幫助臨床進一步認識疾病發病機制，從而為后續診治提供更多可能性[12]。提示應用實時熒光定量PCR 法具有較好的應用前景，可見該檢查方法在結核疾病診治中發揮著重要作用。

值得注意的是，檢驗過程中可能會因個體免疫差異較大，取材標本中Taq 酶抑制劑因子含量高影響PCR 擴增進程，進而導致假陰性結果出現，且還會受患者用藥影響。為進一步提高對病情的判斷，可綜合其他檢查結果來進行評估，以提高準確率，幫助患者盡快接受診治。

綜上所述，結核病對人體安全和社會安全影響大，需要加強防治，應用實時熒光定量PCR 檢驗方式，能夠提高MTB 診斷準確率，能夠為患者后續治療提供有利的診斷依據，臨床可應用。