顱內膠質瘤患者血清中微小RNA-34/194表達與患者生存期的相關性

王喜梅 單艷華 夏建華

顱內膠質瘤也稱為腦膠質瘤[1]，患者生存率極低，即使目前臨床上治療腦膠質瘤的手段已有極大突破，但患者術后的生存率依舊未改善[2]。近年來，分子生物學在腫瘤的基因診斷和治療方面有了重大突破，利用微小RNA(miRNA)研究新型靶向藥物是目前的研究熱點。miRNA可通過調節信號通路，對腦膠質瘤細胞增殖產生影響，如表皮生長因子受體(EGFR)通路、p53通路及轉化生長因子(TGF)通路等[3]。miRNA在膠質瘤中表達上調或下調，對腫瘤細胞產生抑制或促進的作用[4]。miR-34在腫瘤細胞中呈較低的表達趨勢，通過對p53信號通路的調控，發揮抑癌作用。miR-194在腦膠質瘤中的表達水平下調，對Bmil基因和CDH2蛋白的表達均有抑制，從而發揮抑癌的作用[5]。本研究主要探究顱內膠質瘤組織中miR-34、miR-194表達與患者生存期的相關性，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年6月至2018年6月收治的92例行膠質瘤切除手術的顱內膠質瘤患者作為研究組。納入標準：①符合《腦膠質瘤診療規范(2018年版)》[6]中的診斷標準；②卡氏評分大于 80分；③第一次手術；④未經放化療；⑤完成手術并出院。排除標準：①合并其他惡性腫瘤疾病；②合并自身免疫病；③患者資料不完整。選取同期64例行顱內減壓術的非惡性腫瘤患者為對照組。研究組患者男性49例，女性43例；年齡31～80歲，平均年齡(54.29±3.61)歲；根據世界衛生組織(WHO)中樞神經系統腫瘤分類[7]，腦膠質瘤Ⅰ級7例，Ⅱ級36例，Ⅲ級29例，Ⅳ級20例。對照組患者男性38例，女性26例，年齡30～80歲，平均年齡(55.01±3.03)歲。2組研究對象性別、年齡等資料無統計學差異，具有可比性(P>0.05)。

1.2 方法

檢查血清中miR-34和miR-194表達：采集研究組手術前后及對照組清晨空腹靜脈血9 ml，離心15 min，3000 r/min，使用實時熒光定量PCR法檢測血清中miR-34和miR-194的表達水平。操作步驟：取血清樣本，采用mirVanaTMPARISTM試劑盒(Ambion-560)提取血清中的RNA總量，使用超微量核算蛋白測定儀(ND-2000)檢測其RNA的濃度和純度，利用DNAaseⅠ酶除去血清中的DNA，采用TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit試劑盒進行反轉錄。加入miR-34、miR-194引物，探針序列為：has-miR-34：UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU，has-miR-194：UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA。PCR反應體系：4.5 μL反轉錄產物，0.5 μL TaqMan mircoRNA assay(5×)，5.0 μL TaqMan Mix。PCR反應條件：95 ℃預熱6 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min ，循環40次。采用相對定量法計算miR-34、miR-194相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 研究組手術前后及對照組血清中miR-34、miR-194的水平比較

研究組手術前血清中miR-34、miR-194水平均比對照組低(P<0.05)，手術后血清miR-34、miR-194水平均上升(P<0.05)，但仍低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 研究組手術前后及對照組血清中miR-34、miR-194水平對比

2.2 腦膠質瘤Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級患者手術后miR-34、miR-194水平比較

研究組患者根據WHO分級，將其分為腦膠質瘤Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級。92例腦膠質瘤患者術后組織中的miR-34表達水平的平均值為1.35，miR-194表達水平的平均值為1.24，以此作為標準，分為高表達組和低表達組。Ⅰ級患者中miR-34、miR-194均為高表達；Ⅱ級中miR-34高表達有29例，miR-194高表達有28例；Ⅲ級中miR-34高表達有2例、miR-194高表達有4例；Ⅳ級中均為低表達。見表2。

表2 腦膠質瘤Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級患者手術后miR-34、miR-194水平比較/例

2.3 研究組患者術后生存期情況

通過為期3年的隨訪發現，miR-34、miR-194高表達組患者術后6個月、1年、2年、3年生存率均高于低表達組(P<0.05)。見表3。

2.4 ROC曲線分析

經ROC曲線可得，miR-34、miR-194預測患者存活期的AUC分別為0.809、0.764，miR-34、miR-194的截斷值分別為2.11、2.05，兩者聯合預測的AUC為0.882。見表4，圖1。

3 討論

膠質瘤是一種惡性的神經系統腫瘤，其中腦膠質瘤占其40%～60%，目前在臨床上的治療方法主要是腫瘤切除術、放化療等[8]。由于該疾病具有較強的侵襲性，患者在手術后仍存在較高的復發可能性，患者的術后生存期僅有12～18個月。目前關于腦膠質瘤發生、進展的機制尚未明確，并且該腫瘤的生長呈浸潤性，與正常組織無明顯界限，無法通過常規影像學、血常規等檢查方法診斷，因此探討膠質瘤患者預后評估的相關內容具有意義[9]。已有大量研究發現，miRNA的表達水平發生改變，能對多種腫瘤的癌基因以及抑癌基因產生作用，其改變直接對細胞的增殖、分化及凋亡產生影響[10]。miRNA水平的升高或降低引起的抑癌或促癌作用，會對腫瘤患者的病理特征、診斷及預后產生影響。在膠質瘤中表達升高的miRNA可能與腫瘤的惡性程度及轉移存在聯系，而在膠質瘤中表達降低的miRNA可能發揮細胞功能調節的作用，對腫瘤生長和轉移產生抑制[11]。表達下調的miRNA與腫瘤的臨床診斷具有相關性，在預測疾病發展方面具有高靈敏度和高特異度，其可能成為新型的強效的抗癌藥物，用以靶向治療腫瘤[12]。

miRNA-34家族包含miR-34a、miR-34b、miR-34c，具有較高保守性，存在于不同物種中。目前有研究發現，miR-34a-c在多種惡性腫瘤中表達下降，是抑癌因子p53的轉錄靶點，參與調控了p53信號通路，發揮抑制腫瘤的作用[13]。抑癌因子p53能夠抑制細胞的增殖，p53通路異常將引發多種腫瘤，其通過調節miRNA大方式去調節細胞的生長。癌基因、DNA損傷等刺激使p53信號通路活化，調節相關的miRNA，從而發揮抑癌作用。已有大量研究表明，p53激活的miRNA中包括了miR-34，miR-34是p53的靶基因，受到p53的直接調控，且還可以對p53的某些活性調節基因產生調控作用，參與p53的反饋調節[14]。關于miR-34家族的生物學功能研究，主要集中于抑制細胞生長、細胞凋亡及衰老的方面[15]。在哺乳動物的細胞中，miR-34與靶基因結合并抑制其表達，發揮促進細胞衰老的作用，因此miR-34有可能成為老化的一種生物標志物[16]。miR-34能夠抑制細胞的增殖，在腫瘤發展進程中起著抑癌的作用，其在膠質瘤中的水平下降，是因為在啟動子附近的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤島甲基化，使miR-34失去活性，從而在膠質瘤中miR-34的表達水平呈下降趨勢。在腫瘤細胞系中miR-34的表達水平下降，在恢復其表達后，腫瘤細胞的增殖和轉移均受到抑制，表明miR-34產生抑癌作用并且抑制腫瘤細胞的侵襲作用[17]。已證實miR-34對p53通路調控而產生抑癌作用，越來越多的研究更關注于是否能將miR-34開發為一種新型靶向藥物或檢測腫瘤的臨床手段。

miR-194在肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中也承擔抑癌因子的作用，其在腦膠質瘤細胞系中表達水平下降，并且可以靶向調節b細胞特異單克隆鼠白血病毒整合位點基因-1(Bmi-1)，使該基因表達水平下降[18]。Bmi-1基因與神經干細胞、造血干細胞、白血病干細胞的更新和增殖有密切關系，能明顯提高干細胞在機體內的生長和擴增水平。在腦膠質瘤細胞中，Bmi-1基因表達水平較高，能夠促進腫瘤細胞不斷更新，發展為癌癥干細胞，Bmi-1還可以對腫瘤抑制基因產生負調控的作用，調控細胞的周期、凋亡及衰老。miR-194還與靶基因神經鈣黏(CDH2)蛋白的表達水平存在相關性[19]。在腦膠質瘤中，CDH2基因呈高度表達，發揮促癌作用。miR-194在膠質瘤中低表達，并結合靶基因CDH2，降低CDH2基因的水平。miR-194在腦膠質瘤細胞中的表達明顯低于正常腦組織細胞，若miR-194在細胞中過度表達，細胞的增殖能力顯著下降[20]。也有遷移及侵襲實驗表明，miR-194過度表達，細胞的遷移及侵襲能力均明顯下降，而凋亡實驗表明，miR-194過度表達，細胞的凋亡率也增加[21]。多項研究均表明，miRNA-34、miR194在腦膠質瘤細胞中發揮抑癌作用，可以作為新型靶向藥物發展的靶點。

本研究結果顯示，研究組患者手術前的miR-34、miR-194表達較低，經過手術腫瘤切除后，表達水平有所上升，但與對照組患者相比較，水平依舊偏低，說明miR-34、miR-194的表達與患者腫瘤的嚴重情況存在相關性。將研究組患者腫瘤分級，得到腦膠質瘤Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級，比較不同級別腦膠質瘤患者手術后的miR-34、miR-194的表達水平可以得到，腦膠質瘤級別越高，miR-34、miR-194的表達水平越低。根據miR-34的表達分為高表達組和低表達組，比較2組間的生存情況，結果表明miR-34表達越高，則患者的存活率越高。根據miR-194的表達也分為高表達組和低表達組，得到高表達組中6個月時有33例存活，1年有29例，2年有22例，3年有16例；低表達組中6個月有34例，1年有25例，2年有17例，3年有11例，表明miR-194表達越高，則患者的存活率也越高。比較組織中miR-34、miR-194的表達水平單獨及聯合預測顱內膠質瘤患者生存情況可得，將兩個指標聯合，可提高預測顱內膠質瘤患者生存期的特異度及靈敏度。

綜上所述，顱內膠質瘤患者病情越嚴重，其血清中miR-34、miR-194的表達水平越低；且患者術后的miR-34、miR-194的水平越高，存活期越長。ROC曲線顯示miR-34、miR-194的表達水平可以預測患者的生存期，且聯合預測價值更高。