膽道腫瘤復發轉移和預后評估新思路：CTCs及FGFR2研究進展

辛培源，楊振宇綜述 包國強審校

膽道惡性腫瘤(biliary tract cancers, BTC)約占消化道惡性腫瘤的3%，是起源于膽囊和膽管上皮的惡性腫瘤。根據腫瘤的發生部位，BTC分為膽囊癌(gallbladder carcinoma，GBC)和膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA) ；BTC具有惡性程度高、早期診斷困難、易復發轉移、預后差等特點，其5年生存率在5%左右[1-2]；其發病隱匿，早期陽性體征不明顯，出現癥狀往往已到疾病中晚期。現階段臨床上常聯合非特異性腫瘤標志物CEA、CA19-9 等與增強CT、磁共振等影像學檢查進行腫瘤的診斷和分期，但這2種方法特異度及性價比均不高[3]。近年來，循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)在腫瘤疾病的早期診斷、監測治療效果、評估預后等方面逐漸嶄露頭角，是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時監測療效手段[4-5]。其檢測方式相對簡便，與傳統檢查方法相比可早期發現病情變化，更加科學、迅速地評價治療方案的療效；且現在臨床上已有研究證實，CTCs對多種腫瘤的早期復發有預測功能，成為多種腫瘤的獨立預后標志物[6]。CTCs作為一種全新的實時監測腫瘤治療手段，開辟了臨床腫瘤學實時動態監測的新格局,臨床前景廣闊[7]。因此建立基于“膽道系統惡性腫瘤特異性分子特征”的CTCs液體活檢系統，對于提高膽道系統惡性腫瘤患者早期診斷率和預后判斷有重要的臨床意義。

1 循環腫瘤細胞(CTCs)概述

自19世紀澳大利亞醫生Ashworth提出循環腫瘤細胞CTCs的概念以來，臨床上對于循環腫瘤細胞研究一直在深入進行。

1.1 CTCs來源與檢測 CTCs一般從實體腫瘤(原發灶、轉移灶)上脫落，進入外周血液循環[8]。其中大部分腫瘤細胞進入人體外周血參與血液循環后，會被免疫細胞吞噬或發生凋亡，只有少數腫瘤細胞可以躲避機體免疫并逃逸，錨著在身體的其他器官或組織上發展成為轉移灶，引起腫瘤的復發與轉移[9-10]。這些脫落的腫瘤細胞在血液中十分稀少，平均107個白細胞里含有1個CTCs，這也使得目前大量用于分離CTCs的技術都遵循著“富集”和“探測”的原則。“富集”依賴于細胞自身的物理屬性，而“探測”則通過免疫染色和顯微鏡或通過基于PCR的方法實現。目前在研究中最為成熟的檢測CTCs的方法是免疫磁捕獲法富集，即半自動CellSearch平臺(Janssen Diagnostics，Raritan，NJ，USA)使用涂有上皮細胞黏附分子(EpCAM)的鐵磁珠對CTCs進行富集，并根據形態特征、細胞角蛋白陽性表達和缺乏白細胞標志物CD45來分辨CTCs[11-12]。

1.2 CTCs與腫瘤轉移 目前循環腫瘤細胞理論、自我種植假說等現有的腫瘤轉移相關理論都認為循環腫瘤細胞在腫瘤轉移中發揮了重要作用[13]。隨著臨床上對CTCs的研究不斷深入，近年來越來越多的研究發現，大多數惡性腫瘤細胞在脫離腫瘤病灶進入外周血循環的過程中會發生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，腫瘤細胞發生EMT后可以促進CTCs產生并且還可提高CTCs的生存率，EMT也可促進CTCs轉變成為腫瘤轉移灶[14]。研究表明，EMT是腫瘤轉移進展過程中重要的環節之一，腫瘤細胞發生EMT是導致腫瘤預后差、耐藥性增加及治療效果降低的重要因素之一，發生EMT的CTCs不僅更容易于從腫瘤組織中分離出來，侵入到毛細血管中，提升自身生存能力和轉移潛力，而且還會出現型別的變化，形成上皮型、間質型及上皮—間質混合型等不同類別[15-16]。有研究發現，CTCs不僅在外周血中以單個細胞存在，還會以細胞團(CTM)形式存在。間質型CTCs和CTM具有更強的轉移潛能，更容易在外周血液循環中存活，引發腫瘤的復發與轉移[17]。可見，了解CTCs不同型別及其變化情況，對于指導腫瘤臨床治療至關重要。

1.3 CTCs與腫瘤預后 目前關于CTCs與膽道腫瘤新輔助化療療效相關性的報道較少。2017 年，Awasthi等[18]對CTCs在膽囊癌中的作用機制進行研究，在27例膽囊癌患者中，有25例在外周血中發現CTCs。研究中提到，利用CTCs計數在1的分界點來明確CTCs與膽囊癌的敏感度、特異度和診斷準確性，其結果分別為 92.6%、91.7%和 92.3%。CTCs計數水平與已知預后指標的臨床病理參數顯著相關，在>4 的分界點具有顯著的診斷潛力，可區分疾病分期Ⅰ、Ⅱ 期和 Ⅲ、Ⅳ期 GBC。以>6為分界點可以鑒別轉移性和非轉移性的 GBCs，其敏感度、特異度和診斷準確性為 55.6%、100.0%和 85.2%。Sun等[19]對壺腹部癌的 CTCs展開相關研究，62 例樣本中 43 例(69.4%)每 3.2 ml全血可檢測到大于2個 CTCs，其中 16 例(25.8%)可檢測到大于5個CTCs。以每3.2 ml全血2個CTC為界值，檢測敏感度為69.4%、特異度為95.8%，且與較短的無進展生存時間(PFS)相關。吳孟超團隊研究發現，膽道惡性腫瘤患者外周血CTCs相比于良性疾病患者計數顯著升高，陽性率增加，惡性膽道腫瘤的分期與外周血CTCs呈正相關[20]。而吳睿等[21]研究發現，術前CTCs技術作為一種診斷指標在區分膽道惡性腫瘤疾病時，具有更高的診斷價值，可作為傳統腫瘤標志物的輔助參考依據。溫志堅[22]研究發現，CTCs是膽囊癌診斷、病情監控和預后監測的重要指標，在膽囊癌的臨床診治中具有較大的研究和應用價值。Liu等[23]研究發現，基于CTCs的潛在臨床價值通過組合 CD45、DAPI 和 CEP8-FISH 進行檢測染色，CTC水平被證明與膽道壺腹腫瘤發展程度有關。Catenacci等[24]發現從胰膽管的入口采取靜脈血監測其中CTC的數值，此技術可用于研究胰膽管腫瘤的發病機制和進展，協助診斷或預測，以分析癌癥復發或發展轉移的風險。Leelawat等[25]在研究中發現血液中CTCs為預測晚期惡性膽道阻塞患者的整體生存提供了有價值的標志。CTCs在膽道系統惡性腫瘤轉移過程中發揮重要的作用，CTCs的計數、分子分型和分子特性的相關檢測對于膽道系統惡性腫瘤的早期診斷、監測治療效果、評判復發轉移等有著重要的指導意義。

2 成纖維細胞生長因子受體(FGFR)

2.1 FGFR2的生物特性 成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)是一種跨膜酪氨酸激酶受體,通過與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，FGFs)結合參與體內多種生理過程并發揮重要作用，其包括4種類型，即FGFR1～4，并在人體細胞中廣泛存在，參與機體的各種生化反應，如胚胎發育過程中器官的生成，組織的修復和再生等[26]。 FGFs在新陳代謝、膽汁酸和礦物質—磷酸鹽穩態、調節細胞周期的分化、增殖和存活、調節組織纖維化、缺血性損傷后的心臟保護和上皮/傷口修復中都發揮著重要作用[27]。

2.2 FGFR與腫瘤發生的關系 FGFR在各種代謝及細胞生長、增殖和凋亡途徑中發揮作用，研究發現FGF-FGFR信號中的任何異常都可能導致腫瘤的發生[28-30]。FGF配體和FGF受體在硫酸肝素蛋白多糖的激活下，形成FGF-FGFR二聚體。FGF-FGFR二聚體復合物激活下游酪氨酸激酶通路，導致蛋白激酶C磷酸化。引起PI3K-Akt/蛋白激酶B通路、JAK/ STAT通路、RAS-MAPK-ERK通路及其他轉錄調節因子的激活[31]。而細胞的增殖、凋亡等過程都與上述通路密切相關。因此，FGF-FGFR軸發生異常時則可通過影響細胞的存活/凋亡、增殖、遷移和血管生成過程，進而導致腫瘤的發生。其致癌機制大致可歸因于染色體易位引起FGFR自身二聚化和激活、FGFs與促進血管生成的血管內皮生長因子(VEGFs)相互作用和染色體畸變導致配體依賴和獨立的腫瘤形成和增殖三方面[32]。Molotkov等[33]研究指出，基因突變、重排或移位造成的FGFR2信號通路的改變在多種癌癥的發生發展過程中均發揮著重要的作用。基因組學研究也提示，在膽管癌內常見FGFR2融合，包括FGFR2-BICC1，FGFR2-AHCYL1，FGFR2-TACC3等[34]。可見，FGFR2在膽道惡性腫瘤的發生中起著極為重要的作用，因此將其作為新的治療靶點，是值得嘗試的新方向。

2.3 以FGFR2為靶點的治療現狀 隨著新的高通量分子生物學檢測方法的發展，臨床上已經可以針對膽管癌中一些有效的基因治療靶點做出相關鑒定。有研究發現，特定的基因靶向治療藥物可有效地提升FGFR2基因表達異常膽管癌患者的預后[35-36]。2020年FDA數據顯示，FGFR2基因融合在膽管癌患者的發生率為9%～14%。在特定的膽管組織來源腫瘤中，這一比例甚至更高，在部分臨床研究中發現在肝內膽管癌患者中，FGFR2基因融合/易位的發生率顯著升高[30, 37]。而在治療上，有研究發現某些靶向藥物，如BGJ398對存在FGFR2融合的膽管癌患者具有明確療效[38]。Wahiduzzaman等[39]研究發現，在促進膽管癌細胞FGFR2基因過表達后48 h，細胞增殖能力較未做處理的對照組相比明顯增加，說明FGFR2基因表達具有促進膽管癌細胞增殖的作用。這些研究提示，FGFR2具有促進腫瘤細胞增殖的能力，在膽道系統惡性腫瘤的發生、轉移中也扮演著重要的角色。FGFR2的表達程度也與患者的預后緊密相關[40-41]。

研究表明，肝內膽管癌可能攜帶突變的異檸檬酸脫氫酶基因(IDH1、IDH2)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR1、FGFR2、FGFR3)、Eph受體2(EPHA2)和BAP1(參與染色質重塑的基因)，而且在肝內膽管癌的病例中ARID1B、ELF3、PBRM1、cAMP依賴蛋白激酶A和蛋白激酶B的基因突變發生率更高。但是基因組研究表明，FGFR2畸變與約15%的肝內膽管癌有關，與肝內膽管癌的相關性更高[42]。有文獻指出3%～7%的膠質細胞瘤、3%～6%的膀胱癌與FGFR的基因畸變相關。在小鼠模型中，誘導FGFR3的基因改變可以加速膠質瘤樣腫瘤的進展[43]。而FGFR2基因的過表達已在約有13.6%的病例中被證實與肝內膽管癌相關[44]。現階段基于FGFR基因的研究是臨床上各領域研究的熱點，相關實驗與文獻報道日新月異，但其真實性、有效性仍有待臨床上進一步探究論證。

3 CTCs聯合FGFR2與腫瘤療效監測及預后預測

特異性基因檢測已經是癌癥病理檢測的重要組成部分。但現有基因檢測大多針對腫瘤病灶聚合的細胞，將正常組織細胞與腫瘤細胞區別是當前基因檢測的一大難點。即便NCCN要求所有需要做基因檢測的組織標本均應該先做常規病理檢查和HE染色以防止參雜正常組織細胞，仍然難以保證基因檢測樣本的純潔性[45]。

同時，有研究發現CTCs發生腫瘤上皮間質轉化(EMT)后，其基因表達相對于腫瘤組織細胞會發生顯著改變，因此尋找CTCs各項基因表達水平和腫瘤細胞增殖的聯系有著重要的意義。其中，多個臨床研究發現FGFR2基因的過表達可提升腫瘤細胞的增殖、遷移的幾率，同時CTCs細胞又與腫瘤的侵襲性密切相關。CTCs在腫瘤血行轉移、淋巴道轉移的各個理論機制中均發揮重要作用。越來越多的研究表明，腫瘤細胞發生上皮間質轉化后生存、轉移、侵襲和耐藥能力均會增強，而FGFR2表達增加可能是其重要的原因。因此FGFR作為促進腫瘤細胞增殖的關鍵因子，其基因在CTC細胞的過表達可能是膽道系統惡性腫瘤轉移的關鍵原因。CTC細胞上FGFR2的基因檢測有著為腫瘤轉移及基因治療揭示新的突破口的重要意義。

綜上所述，FGFR2基因的過表達具有促進正常細胞和人膽道腫瘤細胞增殖的作用。但是目前對于FGFR2的研究主要集中在組織樣本中，對血液中CTC細胞上的FGFR2過表達的研究較為缺乏，這些研究有望進一步揭示膽道腫瘤遠處轉移的機制。

4 小結與展望

近年來，隨著對 CTCs檢測技術不斷更新，CTCs對腫瘤患者的臨床應用價值受到高度重視。綜述發現CTCs可作為膽道腫瘤不良預后的預測因子，而且FGFR2基因與膽道腫瘤的不良預后及膽道腫瘤的微轉移有密切的聯系，目前針對 CTCs和FGFR2與膽道腫瘤預后相關研究較少，但具有廣闊的臨床研究前景。得益于納米技術和多重RNA原位分析技術及單細胞測序技術的廣泛應用，臨床上實現了外周血中各類CTCs的檢測、分離。CTCs和FGFR2基因的檢測可成為膽道系統腫瘤免疫治療的新方向，從而指導抗癌藥的研發，改善患者的預后。CTCs及其FGFR2基因的檢測將會給臨床醫生對膽道系統惡性腫瘤患者的早期診斷、病情和療效的監測評估及預后預測提供有價值的指標，然而在其應用于臨床前，仍需要進行多中心、多變量、多領域的大型研究作為理論支撐。