牙齦間充質干細胞遞送支架載體的研究進展

王法程，郝鵬杰，盧志山

牙齦間充質干細胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)是存在于人類牙齦間充質組織中未分化的細胞，具有自我更新、多向分化和免疫調節的能力[1]；在促進骨、肌肉、神經和牙周組織的再生，促進傷口愈合，治療口腔腫瘤、唾液腺疾病、種植體周圍炎等方面具有巨大的應用潛力[2]。牙齦組織在臨床上容易獲取，GMSCs來源廣泛，并且其具有諸多優良特性，因此GMSCs是一種較為理想的種子細胞。

組織工程技術包括種子細胞、支架材料和生長因子三個方面，將干細胞懸液接種于支架材料并植入組織缺損處是組織工程的常用方法[3]。支架載體不僅可提供細胞機械支撐、保護細胞免受體內有害微環境的影響，還可以促進細胞的存活、增殖和分化[4]。本文就牙齦間充質干細胞組織再生中，維系GMSCs活性的細胞遞送支架載體的研究進展作一綜述。

1 天然高分子材料(natural polymers)

天然高分子材料是動、植物體內天然存在的大分子材料，是最早使用的支架材料，因具有良好的生物相容性而被廣泛應用，其有利于間充質干細胞的粘附、分化和增殖，常用于組織工程的天然高分子材料主要有：藻酸鹽、膠原、殼聚糖等[5]。

1.1 藻酸鹽類

藻酸鹽是從褐色海藻中提取的天然多糖，具有良好的生物相容性、凝膠性和交聯性，長期以來都被認為是一種優秀的植入材料[6]。Moshaverinia等[7]制備了可注射、可降解的海藻酸鈉微球遞送載體，結果表明，海藻酸鈉作為牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和牙齦間充質干細胞細胞遞送支架是一種很有前途的候選材料，具有將PDLSCs和GMSCs定向分化為骨組織和脂肪組織的能力，證明了海藻酸鈉微球可作為PDLSCs和GMSCs的細胞遞送載體，為骨組織工程提供了一種有前途的策略。

然而，由于海藻酸鈉的生物惰性使其在體內降解困難，限制了細胞的粘附、延伸和遷移。因此，有研究將海藻酸鹽進行化學修飾，來增強包封干細胞的活性，增加其降解率以增強干細胞的增殖和粘附，或將信號分子遞送到封裝在支架中的干細胞內。有研究表明[8]，封入RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽)偶聯藻酸鹽微球支架的GMSCs對免疫缺陷小鼠的顱骨缺損具有修復作用，以TGF-β1為載體的新型RGD偶聯海藻酸鈉微球支架能夠影響GMSCs的活性，誘導其向軟骨細胞分化，且TGF-β1在海藻酸鈉微球中具有緩釋作用。Diniz等[9]還利用一定濃度的乳酸銀能夠對鈦表面的伴放線放線桿菌產生抗菌活性的特點，制備了一種含有乳酸銀(silver lactate，SL)的RGD偶聯海藻酸鹽水凝膠支架作為具有抗菌特性的干細胞遞送載體，體外實驗證明了該GMSCs細胞遞送載體對治療種植體周圍炎的作用，其不僅擁有乳酸銀的抗菌特性，還具有GMSCs成骨特性，為未來治療種植體周圍炎和骨組織工程技術提供了新的思路和方法。隨后，Ansari等[10]改進了GMSCs細胞遞送載體，制備了基于海藻酸鈉和明膠甲基丙烯酸(gelatin methacryloyl，GelMA)的水凝膠制劑，將GMSCs封裝在水凝膠制劑中，結果表明與單純海藻酸鈉支架材料相比，在海藻酸鈉-GelMA水凝膠中，GMSCs的存活率顯著提高且在兩周后GMSCs仍然表達CD146，從而獲得更好的組織再生。研究表明，海藻酸鹽的降解程度受其氧化程度和周圍介質的影響。因此，未來可通過對其不斷的修飾，改進GMSCs細胞遞送載體的性能，來提升GMSCs的成活率和組織再生的成功率[11]。

GMSCs不僅具有成骨定向分化功能，還具有肌肉組織、神經組織分化功能，海藻酸鈉類支架能夠將GMSCs種子細胞包封，使其粘附、增殖和分化。Ansari等[12]制備了一種可注射的具有多種生長因子釋放能力的三維RGD偶聯藻酸鹽支架，用于包封GMSCs，并將微囊化的GMSCs皮下移植到小鼠體內，結果表明GMSCs表現出肌細胞樣形態且有肌肉再生相關基因標記的高水平mRNA表達，而且在小鼠皮下也能檢測出肌肉組織再生，證實RGD修飾的海藻酸鈉水凝膠包裹的GMSCs體系具有多種生長因子的釋放能力，是一種很有前途的肌肉組織工程候選材料。此外，修復或再生受損的神經目前仍然是一個具有挑戰性的臨床難點。Ansari等[13]以海藻酸鈉和透明質酸水凝膠為基礎，制備了海藻酸鈉/透明質酸水凝膠三維細胞遞送載體；在基質和適合信號分子的調控下，包裹在細胞遞送載體中的GMSCs能夠向神經源性組織增殖和分化。

1.2 膠原

膠原(collagen，Co)在自然界中主要存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型5種，骨組織工程中常用的為Ⅰ型膠原，其主要功能就是連接組織和器官，膠原親水性較好，對細胞的生長能夠起到很好的誘導作用。膠原作為胞外基質的主要組成成分，不僅可為干細胞提供附著支架，且具有無毒、生物相容性好的特點，同時還是細胞信息載體，可與細胞之間進行分子信號傳遞。Wang等[14]將增強型綠色熒光蛋白標記的GMSCs種植在Ⅰ型膠原凝膠支架上，將其植入到SD大鼠下頜骨缺損和顱骨缺損處，結果表明實驗組成骨相關基因表達更高，組織形態學分析和熒光顯微鏡圖像分析也證實缺損區的新骨形成來源于移植的GMSCs。

然而，由于膠原缺乏一定的機械強度，導致其在一定外力作用下無法為其內的干細胞保障適當的生存空間。因此，今后在膠原的力學性能或者膠原與其他支架材料復合等方面需進一步的研究。為了解決膠原作為支架的這一缺點，目前已有商品化的三維膠原支架，比如BioRipar(BioR)牛心包膠原膜、MatriDerm?生物相容性支架。BioRipar(BioR)牛心包膠原膜是一種新型三維膠原支架，有研究將GMSCs接種到BioR上，并使用抗壞血酸(ascorbic acid，AS)處理，結果表明GMSCs在BioR膠原支架的體外環境中，補充AS能夠增強GMSCs的成骨分化能力，并且骨特異性標記物的表達明顯上調[15]。MatriDerm?是一種含有膠原蛋白的三維生物相容性支架，具有生物材料的自然特征和特性，Cristaldi等[16]研究表明，GMSCs能夠在Matriderm?膠原支架中生長、均勻分布，并且成骨分化能力得到提高，Matriderm?膠原支架可用于開發較低成本和無痛的口腔自體骨組織再生的臨床治療策略。

1.3 殼聚糖(chitosan，CS)

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，殼聚糖無毒、無刺激，生物安全性優良，有一定的抗菌性，是一種帶正電荷、高電荷密度的堿性多糖；其植入體內后，在生理pH條件下聚合物可部分解離，這使得殼聚糖可作為帶負電荷的生物活性物質的控釋載體[17]。殼聚糖本身降解速率較緩慢，且無法調節，加工性能差，單獨使用不能滿足作為支架材料的要求，這限制了單一殼聚糖作為組織工程生物支架的使用。但是，殼聚糖骨架上含有大量的羥基和氨基，非常適合對其進行改性來制作出具有優越性能的殼聚糖復合支架材料。因此，有學者合成了不同殼聚糖含量的高性能3D-明膠-殼聚糖復合水凝膠，將人骨髓間充質干細胞接種于此復合水凝膠中，并在人血小板裂解物(human platelet lysate，hPL)存在的情況下評估干細胞的增殖和成骨分化能力，結果表明，明膠-殼聚糖復合水凝膠作為干細胞遞送載體與hPL結合應用能夠促進骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化[18]。Shi等[19]成功分離出GMSCs外泌體，采用冷凍干燥法制備了殼聚糖/蠶絲水凝膠海綿，并將其作為GMSCs外泌體的細胞遞送支架載體材料，促進了糖尿病大鼠皮膚創面細胞外基質再上皮化，促進了血管生成和神經元的生長。這一發現不僅有助于探索GMSCs來源的外泌體在傷口愈合中的作用，而且為GMSCs來源的外泌體在非侵入性皮膚組織修復中的應用提供了一種新的思路和方法。

2 人工合成材料(synthetic polymers)

人工合成材料主要包括人工合成的有機高分子聚合物、無機材料等，其優勢在于可通過調整材料的分子量、組成比例及組分，來滿足不同的組織工程對細胞支架的需求。

2.1 聚乳酸(polylactic acid，PLA)

聚乳酸是一種人工合成的單體，具有良好的機械強度和熱塑性，它還是一種可生物降解性材料，其降解產物為乳酸，無細胞毒性。Diomede等[20]通過富含GMSCs和條件培養基(conditioned medium，CM)的3D-聚乳酸(3D-PLA)支架探討了其成骨能力和大鼠顱骨缺損再生的能力，結果顯示成骨相關基因表達上調，GMSCs在3D-PLA載體支架中具有良好的成骨能力。骨組織再生過程需要提供成骨和血管生成微環境以促進成骨生長，近年來富含GMSCs和/或其衍生物胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的3D生物材料也取得了良好的效果。Pizzicannella等[21]將GMSCs/EVs包封到3D-PLA支架材料中，結果顯示成骨和血管生成標記物RUNX2、VEGFA、OPN和COL1A1的表達均增加，并且，植入3D-PLA/hGMSCs/EVs的大鼠組織學檢查也證實了骨再生和血管化過程的激活。EVs攜有蛋白質、mRNA和microRNA，并可轉移到靶細胞中，這可能與缺損部位骨再生和血管形成能力增強相關。因此，將EVs與3D-PLA合成復合支架材料，能夠為骨組織再生的血管形成提供新的策略。通過改進生物支架材料的方法，促進骨組織再生和血管化形成，是骨組織再生醫學的重要研究方向。

2.2 聚己內酯(polycaprolactone，PCL)

聚己內酯是美國食品和藥物管理局(FDA)普遍認為安全的一種合成聚合物。它具有良好的生物相容性，在體內完全降解為CO2和H2O，已經被批準應用于藥物輸送和醫療器械，研究者們也已將PCL微球用于控釋給藥系統和組織工程支架中[22]。Jauregui等[23]使用健康牙齦來源和患病牙齦來源的GMSCs與電紡聚己內酯支架結合分別培養，一段時間后觀察顯示兩組細胞都存在成骨過程，但來自健康牙齦的細胞具有較高的礦化水平而來自患病牙齦的細胞顯示礦化比較不明顯，但其顯示出更高的脂肪生成的傾向。這一研究不僅表明PCL支架材料可用于GMSCs細胞遞送載體，而且該實驗為細胞取材提供了一種新的道路，同時也提示我們未來骨組織工程中應謹慎選取細胞來源，以防其不能成骨或者成骨能力較弱不利于最終的結果。

2.3 聚乳酸-聚羥基乙酸(polylactic acid-glycolic acid，PLGA)

研究表明，PLA有可能引發動物體內鄰近軟組織的炎癥反應，甚至引起骨吸收[24]，基于聚乳酸的干細胞遞送載體支架開發應充分考慮其安全性。為解決聚乳酸的上述問題，常將聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)聚合制成聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)，PLGA的機械性能、降解率和微結構等在生產過程中易于調控，具有適宜的孔隙率，利于種子細胞生長，并能促進毛細血管網的形成，是目前最成功的可生物降解聚合物之一，已成功應用于骨、軟骨、角膜和神經等組織的再生[25]。雖然PLGA具有良好的生物相容性和生物降解性，但PLGA疏水性較強且缺乏細胞或組織的配體，不利于周圍細胞和組織附著，其酸性降解產物也易導致發生無菌炎癥，因此有研究通過不同方法對PLGA進行改性以便提高其作為間充質干細胞遞送載體的性能。劉垚杉等[26]采用絲素蛋白對PLGA多孔微球進行改性，形成絲素改性PLGA多孔微球，其有利于GMSCs的初期粘附、增殖，且誘導成骨分化后在微球支架上有明顯的鈣結節沉積。絲素改性的PLGA多孔微球是良好的細胞遞送載體，為進一步修復牙槽骨缺損提供了科學依據。

2.4 無機材料

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是目前研究最為廣泛的無機材料，它與天然骨中無機鹽的成分十分接近，并且其能在體內與天然的骨組織形成一定的骨結合，具有優越的機械強度[27]，除此之外，將HA進行加工改性后還能獲得其他特性，Mahon等[28]研制了一種具有免疫調節功能的含有仿骨納米羥基磷灰石顆粒(bone mimetic nano hydroxyapatite particles，BMnP)的遞送支架，通過動物實驗，發現包封在BMnP功能化支架中的MSCs可在大鼠股骨缺損模型的缺損處沉積礦物質，還可觀察到血管結構的生成，并且發現該支架還能夠優先將巨噬細胞極化為抗炎的M2表型，并且以IL-10依賴的方式促進MSCs的成骨分化和礦化，該研究表明，在設計高效的骨誘導支架時，免疫反應的調節可能是一種新的策略。

2.5 其他聚合物

除此以外，用于間充質干細胞遞送載體的聚合物還有聚-L-乳酸(poly-l-lactic acid，PLLA)[29-30]、聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)[31]、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)[32]、聚乙烯亞胺(poly ethylenimine，PEI)[33]等。這些聚合物各具有不同的特點，在牙齦間充質干細胞組織工程中作為細胞遞送載體還有必要深入研究。

3 復合材料(composite material)

目前大部分支架材料都存在一定的不足，因此限制了單一支架材料的臨床應用與研究，所以研究人員常將兩種或者兩種以上的材料通過物理、化學混合或改性的方式來提高其力學和生物學特性，利用其組成部分各自的優勢，以期獲得良好性能的復合支架材料。

3.1 PLGA相關復合材料

在引導骨組織再生中，學者們通過靜電紡絲法制備了不同的PLGA相關細胞遞送載體，如含有磷酸八鈣(octacalcium phosphate，OCP)的PLGA/聚己內酯(PCL)納米纖維膜(PLGA/PCL/OCP)[34]、電紡凹凸棒石(attapulgite，ATT)摻雜PLGA的復合支架PLGA/ATT[35]、魚膠原蛋白(FC)和生物活性納米羥基磷灰石(nanohydroxyapatite，n-HA)增強的PLGA納米纖維膜[36]等，實驗表明這些復合支架有利于骨髓間充質干細胞的粘附、擴散和增殖，增強堿性磷酸酶的活性，促進礦化骨結節的形成，有望成為有前途的GBR細胞遞送復合支架材料。然而，這些PLGA復合遞送載體是否能夠促進牙齦間充質干細胞的骨分化潛能有待于進一步研究。

3.2 聚乳酸(PLA)-聚乙烯亞胺(PEI)復合材料

有學者將聚乳酸(PLA)和聚乙烯亞胺(PEI)復合形成支架材料(PLA-PEI)，并將胞外膜泡(EVs)封入復合生物支架中，以模擬體內微環境，評價GMSCs的骨缺損再生能力，結果表明PLA-PEI-EVs具有較高的成骨誘導能力，將其植入大鼠骨缺損部位后，能夠促進缺損部位骨的愈合[37]。

3.3 生物質復合材料(bio-composites)

生物質材料(biomass)是一種材料學的概念，是指主要由碳、氫、氧三種化學元素組成的有機高分子物質，其來源于動植物，降解產物可再次進入自然界循環，而且還具有來源廣泛、價格低廉等優點，主要包括：膠原、殼聚糖、PLA、纖維蛋白原、β-葡聚糖、透明質酸等[38]。當聚合物復合材料中含有特定的生物相時，我們將其定義為生物質復合材料。生物質復合材料作為支架材料在骨組織工程、皮膚組織工程和傷口愈合等方面已經有了長足的發展[39]。Jindal等[40]將介孔硅酸鋅(mesoporous zinc silicate，mZS)和殼聚糖復合制成mZS/CS生物質復合材料的復合支架，通過實驗發現支架材料內的小鼠間充質干細胞可在體外進行礦化，mZS的復合改善了殼聚糖支架的孔隙率和降解率，并且該支架對金黃色葡萄球菌有抗菌作用，在臨床應用時，能大大降低植入人體后感染的風險。此外，研究者們還開發出了明膠和黏液酸包裹的3D聚乳酸支架[41]、木葡聚糖-甲基丙烯酸/羥基磷灰石/SiO2支架[42]、銀包裹的β-葡聚糖/納米羥基磷灰石支架[43]等用于骨組織工程，明膠/殼聚糖電紡絲支架[44]等用于皮膚組織工程。這些都是生物質復合材料在組織工程中的應用，其應用大大減少了石油資源的使用，而且產物可生物降解和回收利用，更加符合法律和監管部門的規定，因此，生物質復合材料被貼上了生物可持續產品的標簽，它的開發應用完美地契合了材料學和組織工程學的要求，未來與牙齦間充質干細胞的研究也將得到長久的發展。

3.4 其他聚合物復合支架

理想的支架材料應該有極高的生物相容性、無毒性、低免疫源性、可生物降解、價格低廉等特性，現有的支架材料還達不到應用時的理想要求，學者們不斷探索和尋找各種新型的間充質干細胞3D復合支架材料，如聚己內酯-聚乙二醇-聚己內酯(PCL-PEG-PCL)復合支架[45]、聚3-羥基丁酸酯4-羥基丁酸酯(poly3-hydroxybutyrate4-hydroxybutyrate，P34HB)復合支架[46]、P34HB/聚乙二醇(P34HB/PEG)復合支架[47]、P34HB/PEG/氧化石墨烯復合靜電紡絲支架[48]等。這些復合支架作為骨髓間充質干細胞遞送載體，明顯地改善了細胞增殖、粘附，促進骨的形成，有望成為骨組織工程應用的新型支架，其在牙齦間充質干細胞組織再生中作為細胞遞送載體還有必要進一步深入研究。

4 結 語

總之，干細胞組織工程中理想的支架材料應具有極優的生物相容性、無毒性、低免疫源性、可生物降解、價格低廉、具有一定的機械強度和可塑性、并且具有高孔隙性以允許高密度干細胞的植入，從而為干細胞提供更好的載體平臺，細胞的增殖、遷移等代謝活動才能得到良好的保障。目前，在GMSCs組織再生中采用的細胞遞送支架載體常見有上述天然高分子材料、人工合成材料、復合材料等，然而目前構建制備的GMSCs遞送支架載體尚不理想。隨著納米材料、再生醫學、仿生科學、細胞分離培養技術的不斷提高，將會不斷開發新型的GMSCs-3D細胞遞送支架載體。在未來支架材料大量生產應用、石油資源短缺、生態衛生環境越來越受人們關注的背景下，隨著綠色材料的進一步研究，對膠原、殼聚糖、PLA等可從自然界來源的生物材料制成的復合支架的研究也會更加深入，從而不斷提高GMSCs在促進骨、肌肉、神經和牙周組織再生，促進傷口愈合，治療口腔腫瘤、唾液腺疾病、種植體周圍炎等方面的應用潛力。