外泌體在結腸癌和成纖維細胞間交互影響中的作用研究進展

尹貽倩，陳藝文，趙雨雪，賈曉楠，韓月，鄒晨，茅凌翔，許化溪

(1. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江212002； 2. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 3. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院胃腸外科，江蘇 鎮(zhèn)江212002)

結腸癌是由于癌基因或者抑癌基因遺傳或表觀遺傳突變導致，發(fā)病率位居第3的消化道惡性腫瘤[1-2]，全球每年約有120萬新診斷病例，每年報告的死亡人數(shù)為70萬[3]。據(jù)預測，到2035年全球因結腸癌死亡的人數(shù)將增加60%[4]。結腸癌治療以手術治療和化療放療為主，但仍有40%的結腸癌患者死于腫瘤的轉移和復發(fā)。

19世紀80年代，研究者們提出“種子-土壤”假說來形容腫瘤與腫瘤微環(huán)境的關系。腫瘤微環(huán)境由間質細胞和基質液組成，其中成纖維細胞是腫瘤間質中數(shù)量最豐富的細胞類型，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移。腫瘤細胞也可以通過多種途徑，作用于微環(huán)境中的間質細胞。外泌體是細胞分泌的膜性囊泡結構，其內容物包含蛋白質、脂質和核酸等生物活性分子，是結腸癌細胞和成纖維細胞間交互影響的重要媒介，本文就外泌體在結腸癌細胞和成纖維細胞間交互影響的作用及其機制作一綜述。

1 成纖維細胞

腫瘤微環(huán)境中的間質細胞主要包括成纖維細胞、內皮細胞、周皮細胞等，在實體惡性腫瘤中，成纖維細胞可被激活為腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblast，CAF)，其占據(jù)間質細胞總數(shù)的50%。CAF形態(tài)為長梭形，其增殖能力、蛋白合成能力及細胞周期活性均明顯高于正常成纖維細胞。CAF具有高度異質性，有多種不同表型和功能的亞型，通常根據(jù)不同的標志物來辨別，包括α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，纖維連接蛋白(fibroblast activating protein，F(xiàn)AP)，血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFRβ)，纖維特異性蛋白(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP1 或 S100A4)，小窩蛋白-1(caveolin-1，CAV-1)，CD29[5]和細胞表面蛋白CD10，G蛋白偶聯(lián)受體7和CD146[6]等。

CAF可通過多種方式影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CAF借助合成和降解成分來改變胞外基質，并通過交聯(lián)酶、蛋白酶重塑其結構，建立腫瘤的安全屏障； CAF還通過分泌可溶性介質直接促進腫瘤細胞增殖和生存、促進血管生成。此外，CAF還能發(fā)揮負向免疫調節(jié)作用，助力腫瘤逃避免疫監(jiān)視。

2 外泌體

外泌體是一類直徑為30～150 nm的脂質雙分子層囊泡，包裹多種蛋白質、脂質、核酸和其他代謝物，可以被大多數(shù)類型細胞分泌，并且廣泛存在于尿液、乳液、淚液、腦脊液等體液中[7]。外泌體的形成包括兩個步驟，一是早期核內體膜內陷形成腔內囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，然后成熟為晚期核內體即多泡體(multivesicular bodies，MVBs)；二是MVBs與質膜融合后，將腔內囊泡釋放到胞外，即外泌體。外泌體可以參與多種生理活動，包括細胞間通訊、哺乳動物繁殖和免疫調節(jié)等，并在心血管疾病、神經(jīng)變性和癌癥等疾病的病理進展中起重要作用。近年來，外泌體在腫瘤細胞與成纖維細胞之間的通訊作用成為研究熱點。

3 結腸癌來源的外泌體對成纖維細胞的影響

3.1 激活成纖維細胞

結腸癌源性外泌體對成纖維細胞的影響主要分為兩方面，一是激活成纖維細胞為CAF，二是使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，兩者均能有效地促進結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。結腸癌來源的外泌體中miRNA-10b可直接靶向基質中正常成纖維細胞中的磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位(PIK3CA)，降低PI3K/Akt/mTOR信號通路活性，促進成纖維細胞TGF-β 和α-SMA的表達，從而使其激活為CAF，利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。Rai 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將原發(fā)性結腸癌細胞SW480和轉移性結腸癌細胞SW620分泌的外泌體分別加入靜止的正常成纖維細胞上清液中，成纖維細胞的α-SMA表達顯著增強，基質重塑能力增強，激活為CAF；其中，SW480來源的外泌體激活后的CAF具有高度促進腫瘤增殖和促血管生成的能力，SW620來源的外泌體激活后的CAF具有促腫瘤侵襲的能力。結腸炎可發(fā)展為結腸癌，利用右旋糖酐硫酸鈉誘導小鼠結腸炎后，發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞分泌的胞外囊泡中表皮生長因子能夠激活成纖維細胞，從而利于結腸癌的發(fā)展[10]。抑癌基因p53缺失的結腸癌細胞HCT116來源的外泌體攜帶過量miRNA-4534，通過抑制成纖維細胞自噬相關蛋白2B(autophagy-related 2B，ATG2B)的表達，激活成纖維細胞，從而加速成纖維細胞介導的癌細胞增殖[11]。肌成纖維細胞是一種呈現(xiàn)為激活狀態(tài)的成纖維樣細胞，以α-SMA的表達為特征。在實體癌中，富含肌成纖維細胞的微環(huán)境可以支持腫瘤生長、轉移和血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，結腸癌細胞系Caco-2通過外泌體中TGF-β刺激正常成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，表明結腸癌來源的外泌體是激活成纖維細胞的重要參與者[12]。

3.2 促進成纖維細胞的增殖和遷移

2009年，研究者對人結腸癌細胞SW480進行了細胞轉錄組分析，并首次鑒定出11 327個參與腫瘤發(fā)生相關過程的mRNA，其中有241種mRNA富集于結腸癌細胞來源的外泌體中，27種參與了細胞周期相關的活動[13]，關于這些分子在成纖維細胞中發(fā)揮的作用需要后續(xù)實驗研究。ΔNp73mRNA(p73基因的異構體)與致癌潛能相關，可以被包裹在結腸癌細胞分泌的外泌體中，促進其他結腸癌細胞以及基質中的成纖維細胞、內皮細胞的增殖。并且，外泌體ΔNp73mRNA存在于結腸癌患者的血清中，可作為預后判斷的標志物[14-15]。癌源性外泌體中miRNA被認為是細胞惡化的誘因，通過影響腫瘤微環(huán)境中的血管生成、基質細胞增殖、遷移從而促進腫瘤的發(fā)生。結腸癌細胞分泌的外泌體攜帶一些miRNAs(miRNA-1249-5p，miRNA-6737-5p和miRNA-6819-5p)，抑制成纖維細胞中的抑癌基因p53的表達，從而促進腫瘤的發(fā)展[16]。結腸癌細胞HT-29和SW480來源外泌體中的miRNA-let-7d能夠下調CAF中趨化蛋白(CCL7)的表達，抑制其抗腫瘤免疫反應，從而促進結腸癌的增殖、遷移和侵襲[17]。丁酸鈉誘導分化的人結腸癌細胞HT-29分泌大量的含CD133的外泌體，能夠促進人結腸癌細胞HCT116和大鼠正常成纖維細胞Rat-1的增殖和遷移[18]。

4 成纖維細胞來源的外泌體對結腸癌細胞的影響

4.1 提高結腸癌細胞的耐藥性

5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和氨甲蝶呤是治療結腸癌常用的化療藥物，但是大多數(shù)患者會出現(xiàn)固有和獲得性耐藥，其中位生存期只有20個月左右。因此，關于結腸癌耐藥性機制的問題亟待解決。Hu等[19]將結腸成纖維細胞系(CCD-18Co)和CAF分泌的外泌體分別加入體外培養(yǎng)的結腸癌細胞系SW620衍生和體內分離的腫瘤干細胞中，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞來源的外泌體能夠增加腫瘤干細胞對5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的耐藥性。進一步的研究表明，CAF來源的外泌體能通過Wnt信號通路增加腫瘤干細胞的百分比，促進集落形成和腫瘤生長，從而提高腫瘤細胞的耐藥性。

miRNA是一類具有18～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，可被包裹在外泌體中參與細胞的增殖、分化、代謝和凋亡。CAF利用外泌體轉運miRNA-92a-3p至結腸癌細胞，而高水平的miRNA-92a-3p通過直接抑制靶基因F框/WD40域蛋白7(F-Box and WD40 domain protein 7，F(xiàn)BXW7)和凋亡調節(jié)因子1(modulator of apoptosis 1，MOAP1)，激活Wnt/β-catenin通路，從而抑制線粒體凋亡，促進了結腸癌細胞的干性、間質-上皮轉化、轉移和對5-氟尿嘧啶的耐藥[20]。研究報道，CAF來源外泌體中的miRNA-24-3p可通過結腸癌細胞中尾型同源盒轉錄因子2/膜鐵轉運輔助蛋白(CDX2/HEPH)軸，抑制細胞凋亡和促進腫瘤生長，并且增強結腸癌細胞對甲氨蝶呤的耐藥；而轉染miRNA-24-3p抑制子的CAF來源的外泌體能夠降低結腸癌細胞的活力和集落形成，增加細胞凋亡，抑制體內腫瘤生長，這為提高氨甲蝶呤在臨床結腸癌治療中的敏感性提供一個潛在靶點[21]。近年來，放射治療被認為是減少局部復發(fā)的標準術前治療方法，可促進細胞凋亡。然而，結腸癌細胞對放療產(chǎn)生的耐藥性成為減少結腸癌細胞死亡的主要障礙。放療情況下，CAF分泌的外泌體中含有高水平的miRNA-93-5p，與結腸癌細胞SW480共孵育后，結腸癌細胞的增殖能力和克隆形成能力加強。它的可能調控機制為miRNA-93-5p在結腸癌細胞內通過抑制叉頭框蛋白A1(FOXA1)的表達激活TGF-β信號通路，從而抑制結腸癌細胞的凋亡，增強其對放療的抵抗性[22]。相似地，CAF來源的外泌體中miRNA-590-3p能在結腸癌細胞中抑制其靶基因氯化物通道附件4(CLCA4)，從而激活CLCA4原本抑制的PI3K/Akt信號通路，調節(jié)DNA損傷應答反應，抑制細胞凋亡，增強結腸癌細胞SW620和HCT116對放療的抵抗力[23]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，通過與DNA、染色體、蛋白質等大分子物質作用，調控細胞的生命活動。CAF通過釋放含有高水平lncRNA H19的外泌體，作用于miRNA-41激活結腸癌細胞的Wnt/β-catenin信號途徑，以提高其對奧沙利鉑的耐藥性和促進其干性[24]。結腸癌相關lncRNA(CCAL)可以通過外泌體從CAF轉移到結腸癌細胞，與mRNA結合蛋白HuR相互作用，激活β-catenin信號通路，提高結腸癌細胞對奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶的抵抗性[25]。

4.2 促進結腸癌的轉移和進展

癌細胞轉移是一個多步驟、多階段、多基因調控的過程，涉及癌細胞從原發(fā)部位逃逸、缺乏免疫監(jiān)視和腫瘤微環(huán)境的協(xié)同作用，是結腸癌患者死亡的主要原因。研究者們從結腸癌組織及癌旁組織分別分離出CAF和成纖維細胞，并對它們分泌的外泌體進行miRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)CAF來源的外泌體中miRNA-21豐度最高，且利用結腸原位癌模型證明miRNA-21可通過其外泌體傳遞給結腸癌細胞，促進結腸癌的轉移[26]。Zhang等[27]研究表明CAF來源的外泌體將miRNA-17-5p傳遞給結腸癌細胞，調控RUNX家族轉錄因子3 (RUNX3)信號軸以激活TGF-β1途徑，促進結腸癌的轉移。隨后，大量的TGF-β1被分泌到胞外基質中，反過來激活成纖維細胞，由此形成促進結腸癌轉移的正反饋。研究表明miRNA-135b-5p經(jīng)CAF源性外泌體傳遞到結腸癌細胞，通過下調細胞中硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)表達，促進結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成[28]。

Linc00659是一種lncRNA，已被鑒定為一種新型癌基因，其在結腸癌中的表達水平顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)Linc00659經(jīng)CAF源性外泌體傳遞到結腸癌細胞Lovo和SW480中，通過抑制miRNA-342-3p上調膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)的表達，最終促進結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移和間質-上皮轉化[29]。

此外，CAF來源的胞外囊泡能夠攜帶表皮生長因子家族成員雙調蛋白，促進結腸癌細胞增殖，但是其具體的作用機制未知[30]。

5 外泌體作為結腸癌診斷和預后的標志物

外泌體在結腸癌與成纖維細胞的交流中發(fā)揮信使功能，其運輸?shù)呢浳锱c其親本細胞有一定的相關性，可以作為判斷疾病進展的標志物。研究者們收集88例結腸癌患者和12例健康者的結腸組織樣本，對所有外泌體進行miRNA微陣列分析后發(fā)現(xiàn)，相比于健康者的結腸組織，7種miRNAs(let-7a、miRNA-1229、miRNA-1246、miRNA-150、miRNA-21、miRNA-223和miRNA-23a)在結腸癌患者組織來源的外泌體中表達量較高，或可作為結腸癌早期診斷的標志物[31]。Bahnassy等[32]比較了124例結腸癌Ⅱ期患者和100例健康者結腸組織中miRNA的表達量，發(fā)現(xiàn)miRNA-21、Let-7a-5p、miRNA-100-5p、miRNA-200c-3p和miRNA-23b-3p可作為Ⅱ期結直腸癌常用的診斷標志物，miRNA-21、miRNA-498和miRNA-320可以預測結腸癌的復發(fā)和患者的生存。這些miRNAs是否也存在于結腸癌組織來源的外泌體中，用于結腸癌的診斷標志物還需進一步探究。另有研究通過二代測序技術對CAF和成纖維細胞及其分泌的外泌體中的非編碼RNA進行了檢測和生物信息學分析，其中miRNA-6087 和miRNA-AL353644.1在CAF來源的外泌體中含量更高，并且可能作為結腸癌發(fā)生、發(fā)展的診斷標志物[33]。

Mathivanan等[34]利用免疫捕獲法分離結腸癌細胞系LIM1215來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)了多種具有組織特異性的蛋白，如A33、鈣黏蛋白-17(cadherin-17)、閉合蛋白1(claudin 1)等，可能作為結腸癌診斷的標志物。但是由于當時外泌體的分離、純化、鑒定方法不完善，獲得數(shù)據(jù)的準確性和實用性降低，需要進一步探究。結腸癌細胞來源外泌體中干擾素調節(jié)因子-2(interferon regulatory factor-2，IRF-2)被巨噬細胞吸收，促進淋巴管的生成，可用于預測結腸癌的轉移情況[35]。Ganig等[36]發(fā)現(xiàn)，靜息硫基氧化酶1(quiescin sulfhydryl oxidase 1，QSOX1)蛋白含量在結腸癌患者的血漿以及成纖維細胞分泌的外泌體中顯著下降，因而認為QSOX1是一種有前途的結腸癌早期診斷和無創(chuàng)風險分層的新標志物。除此之外，有研究報道二萜內酯化合物(ovatodiolide)可以通過降低結腸癌細胞分泌的外泌體中β-catenin/STAT3/miRNA-1246的含量，抑制腫瘤干細胞的形成和惡性間質-上皮的轉化，為治療癌癥提供了臨床前證據(jù)[37]。外泌體包裹的這些物質可以作為預測結腸癌發(fā)展的標志物，但不是診斷的金標準，其特異性還需大量研究驗證。

6 結語

結腸癌和成纖維細胞釋放的外泌體在原發(fā)性腫瘤微環(huán)境中對調節(jié)癌癥進展起重要作用。成纖維細胞來源的外泌體參與驅動機制，促進腫瘤生長、遷移、轉移和耐藥性；結腸癌細胞來源的外泌體能更好地調控成纖維細胞，使之更好地輔助腫瘤細胞。結腸癌細胞以及成纖維細胞分泌的外泌體中包裹的miRNA、蛋白等可作為輔助診斷結腸癌轉移、耐藥、預后等的生物標志物，具有潛在的臨床應用價值。