微小RNA-200c在胰腺癌中的研究進展

張 堯， 張 鍇， 康鵬東， 馬 超

鄭州大學附屬腫瘤醫院 肝膽胰外科， 鄭州 450008

胰腺癌是一種侵襲性高、死亡率高的惡性腫瘤。由于早期確診難、侵襲轉移早、放化療抵抗及缺乏有效的靶向治療方案，預后較差[1]。因此，胰腺癌治療的研究探索中，尋找可靠的生物標志物和分子靶標至關重要。近年來，隨著分子生物學技術發展，微小RNA(miRNA，miR)逐漸成為研究熱點，為胰腺癌研究提供新思路和方向[2]。

miRNA是一種廣泛參與機體多種生物學功能的非編碼RNA，主要與靶RNA的3′端非翻譯區(untranslated regin，UTR)結合，導致靶RNA的降解或翻譯終止[3]。研究[4]證實，多種miRNA在腫瘤中發揮癌基因或抑癌基因作用，并影響腫瘤的生物學行為。其中，miR-200家族與腫瘤的關系是近年來的研究重點[5]，目前相關研究[6-7]表明，miR-200c與胰腺癌的發生、侵襲、轉移、預后等諸多方面有密切關系。本文即對miR-200c在胰腺癌中的研究進展進行綜述。

1 miR-200c概述及在胰腺癌中的表達情況

miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-419組成。其中miR-200c、miR-141位于染色體12p13.31，其余位于染色體1p36.33[5]。有研究[8]表明，miR-200c作為抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌等多種癌癥中發揮作用，且通常經由阻斷癌細胞的上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)而表現出抑癌行為。在不同腫瘤細胞系及組織中，miR-200c的表達并不完全相同。

1.1 在胰腺癌組織中的表達 miR-200c已被證實在肺癌[9]、卵巢癌[10]、肝癌等多種癌組織中低表達。Ali等[11]應用細針穿刺活檢術抽取29例胰腺癌組織及15例正常胰腺組織，應用微陣列數據分析檢測發現胰腺癌組織中超過228個miRNA存在異常，對前7個miRNA應用實時定量PCR技術(qRT-PCR)進一步驗證，結果證實大部分胰腺癌組織中let-7c、let-7f和miR-200c表達降低，所有胰腺癌組織中miR-486-5p和miR-451表達顯著升高，let-7d和miR-423-5p表達具備個體化差異。

Pan等[12]應用qRT-PCR 對胰腺癌組織及癌旁組織中的miR-200c表達進行檢測后發現，miR-200c在胰腺癌組織中表達水平顯著低于癌旁組織。為進一步探索miR-200c表達下調的機制，其應用時間飛行質譜技術對miR-200c啟動子甲基化水平進行定量測定，結果顯示miR-200c啟動子高甲基化，且其甲基化水平與miR-200c表達水平呈負相關性。應用DNA去甲基化劑5-Aza-dC處理胰腺癌細胞后，miR-200c啟動子甲基化水平降低，miR-200c表達恢復。在胰腺癌中，miR-200c低表達，且其表達的下調與啟動子的高甲基化有關。

1.2 在胰腺癌干細胞中的表達 胰腺癌干細胞具有自我更新的能力，可能是胰腺癌發生發展的啟動因子，影響胰腺癌的耐藥和轉移[13]。Ma等[14]以CD24+CD44+ESA+作為標志物在人胰腺癌細胞株(PANC-1)中分選出胰腺癌干細胞，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RFQ-PCR)法檢測miR-200c表達，發現miR-200c在胰腺癌干細胞中的表達明顯低于PANC-1。轉染miR-200c前體片段至胰腺癌干細胞中，高表達miR-200c后，胰腺癌干細胞體外侵襲能力明顯降低。miR-200c胰腺癌干細胞中低表達并可抑制胰腺癌干細胞的侵襲能力。

1.3 在血清中的表達 循環miRNA正在成為一種有用的工具，用于各種癌癥的非侵入性診斷和預后評估，Gablo等[15]前瞻性納入112例計劃進行手術切除的胰腺癌患者，把總生存期(OS)<16個月的患者歸類為預后不良，OS>20個月患者歸類為預后良好，qRT-PCR法檢測術前血漿標本中miRNA的表達，結果顯示，多種miRNA在預后不良與預后良好病例的血漿樣本中存在差異化表達，其中，預后不良病例的血漿樣本中，miR-200c顯著高表達。miR-200c在血清中的差異化表達，提示其在胰腺癌的診斷和預后預測中具備巨大潛能和廣闊應用前景。

2 miR-200c與胰腺癌的增殖、侵襲和轉移

EMT使有極性的上皮細胞經過一系列變化失去細胞間聯系轉化為無極性的間質細胞，從而獲得侵襲性和轉移能力，是腫瘤早期轉移的重要步驟[16]。EMT過程中伴隨多種細胞分子標志物改變，包括細胞黏附蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和γ-連環蛋白等的表達下調，而間葉細胞的標記分子如纖維連接蛋白、波形蛋白(vimentin)和N-鈣黏蛋白等的表達上調，其中E-cadherin的丟失為EMT的重要特點[17]。EMT在腫瘤及腫瘤干細胞的增殖、侵襲轉移進程中發揮重要作用[18-20]。多項研究[21-22]表明，miR-200c可通過抑制EMT進程發揮抑癌基因作用。

胰腺癌中，miR-200c同樣參與調控腫瘤細胞EMT進程，Burk等[23]過表達胰腺癌細胞中miR-200c后，E-cadherin表達明顯上調，而轉染miR-200c抑制劑沉默其表達后，E-cadherin表達明顯下調。說明miR-200c直接調節E-cadherin來調控腫瘤細胞EMT。進一步研究[24]證實，miR-200c可直接靶向作用于E-cadherin轉錄抑制因子：ZEB1/2，SNAI1/2，Twist1/2以及EMT激活劑TGFβ來抑制EMT進程。同時，ZEB1也反過來抑制miR-200c表達[25]，miR-200c和ZEB1的相互抑制形成了一個雙向負反饋回路[26]共同調節腫瘤的遷徙和轉移。靶向ZEB1-miR-200c負反饋通路有望成為治療胰腺癌的基礎[27]。近年來隨著腫瘤干細胞研究進展，有研究[28]發現，miR-200c也參與了胰腺癌干細胞EMT過程的調控，轉染前體物質使胰腺癌干細胞中miR-200c高表達后，胰腺癌干細胞中E-cadherin表達明顯上調，vimentin、ZEB1表達明顯下調，Transwell遷徙實驗證實高表達miR-200c后，胰腺癌干細胞侵襲能力較前降低。

此外，除了調節EMT蛋白，miR-200c還影響胰腺癌細胞表面黏蛋白的表達。miR-200c直接靶向胰腺癌細胞中的黏蛋白4(MUC4)和黏蛋白16(MUC16)的mRNA來抑制MUC4、MUC16蛋白的表達[29]，從而逆轉胰腺癌細胞的侵襲。miR-200c還通過其他通路調控胰腺癌細胞的浸潤轉移。Huang等[30]應用TargetScan數據庫預測出Notch1是miR-200c的作用靶點，而Notch1被證實參與了胰腺的胚胎發育與分化[31]，在胰腺癌中起重要作用。轉染miR-200c使其在胰腺癌干細胞中高表達后，Notch1免疫熒光強度降低，胰腺癌干細胞的干細胞樣特性和轉移潛能被抑制。miR-200c作用于Notch1的3′UTR，下調其mRNA及蛋白的表達。

也有研究[32]指出，miR-200c是轉移相關肺腺癌轉錄本1(matastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)的直接靶點。Zhuo等[33]應用qRT-PCR檢測胰腺癌組織中MALAT1和miR-200c的表達，轉染MALAT-1使其高表達后，胰腺癌組織中miR-200c表達較前明顯降低，同樣，miR-200c高表達后，MALAT-1表達明顯降低。二者表達相互抑制，可能形成一個新的反饋回路。進一步分析表明，胰腺癌組織中MALAT-1與ZEB1的表達呈正相關，miR-200c與MALAT-1、ZEB1的表達呈負相關。這一方面是因為MALAT-1可以作為競爭性內源性RNA抑制miR-200c的表達，另一方面因為miR-200c與靶RNA的3′UTR結合，沉默靶基因抑制MALAT-1表達。Transwell遷徙實驗發現，MALAT-1促進胰腺癌侵襲、轉移，miR-200c則起抑制作用，當同時沉默MALAT-1和miR-200c時，對比單獨沉默MALAT-1，腫瘤細胞侵襲性升高，miR-200c的抑制部分逆轉了侵襲性降低。

3 miR-200c與胰腺癌診斷及預后

胰腺癌因早期癥狀不典型、缺乏特異性診斷標志物從而難以實現早期診斷，進而導致預后不佳。如何提高胰腺癌高危人群早期篩查確診率一直是臨床工作中的重點和難點。目前，雖然miR-200c等因子在胰腺癌患者血清中的表達變化已有相關研究報道，提示與患者預后相關，但miR-200c在胰腺癌中的診斷價值仍需進一步大樣本研究。miR-200c等因子與血清腫瘤標志物聯合檢測，多指標共同診斷或能提高胰腺癌的診斷準確度。

miR-200c在胰腺癌組織中及患者血清中的表達均提示與預后相關。Soubani等[34]從99例施行胰十二指腸切除術的患者中獲得胰腺癌組織，qRT-PCR法檢測miR-200c表達并分為高表達組和低表達組，分析其與預后的關系。結果顯示，miR-200c的低表達與胰腺癌的淋巴結轉移、TNM分期、血管浸潤(陰性或陽性)顯著相關；高表達miR-200c組OS更長。一項關于miRNA與胰腺癌預后的Meta分析顯示[35]，miR-200c低表達患者生存期明顯縮短，提示miR-200c低表達是手術切除后患者預后不良的重要預測。Gablo等[15]的前瞻性臨床試驗發現循環miR-200c的表達與患者OS相關，提示血漿中miR-200c可能作為生物標志物來監測腫瘤動態和預測胰腺癌患者預后。因此，組織miR-200c的低表達一定程度上可以提示癌癥患者的不良預后，然而，晚期癌癥患者中，循環miR-200c的高表達則提示患者的預后不良。

4 miR-200c與胰腺癌治療

miR-200c與化療耐藥密切相關，Li等[36]將胰腺癌細胞分為吉西他濱敏感和吉西他濱耐藥，檢測兩組胰腺癌細胞中miRNA的表達，發現吉西他濱耐藥細胞中miR-200b、miR-200c、let-7b、let-7c、let-7d和let-7e的表達顯著下調，而E-cadherin、vimentin、ZEB1等蛋白高表達。研究[37]發現，ZEB1和其他EMT調控因子可能維持人胰腺癌細胞的耐藥，進一步實驗證實，miR-200c靶向沉默ZEB1，不僅上調了E-cadherin的表達，還增加了其他上皮標志物，如EVA1和MAL2的表達，恢復了胰腺癌細胞對吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑等藥物的敏感性。探索miRNA與胰腺癌傳統治療的相互關系，可以為胰腺癌的治療打開新的突破口。miRNA與化療藥物的聯合治療也是一個潛在的、有前景的研究方向，既可以利用miRNA的優勢靶向多個信號通路，又可以發揮抗癌藥物的細胞毒性作用、減少胰腺癌細胞的化療耐藥性[38-39]。

隨著技術手段的不斷進步，許多臨床研究開始探索miRNA在臨床治療中的應用。miRNA應用于腫瘤治療，主要依靠直接或間接下調原癌miRNA的表達或上調抑癌miRNA的表達來實現[2]。治療性miRNA必須通過多重生物屏障，包括全身血液環境、腫瘤組織和腫瘤細胞微環境等[40]，靶向調節目標miRNA的表達。在這個過程中，為提高miRNA的生物穩定性和靶向治療性，常借助脂質載體、細胞外囊泡、miR-納米顆粒結合物、miR海綿等各種運載工具[41]。抑癌性miRNA如miR-200c再表達具有廣泛的應用前景和臨床意義，但需要進一步研究相應的模擬劑和發現更有效的運載系統，從而得以應用于臨床治療。

5 小結與展望

近年來，胰腺癌發病率呈不斷攀升趨勢，對于胰腺癌的發病機制、診斷、治療的研究仍未取得突破性進展。miRNA作為備受關注的研究熱點，已經證實在多種腫瘤的增殖、侵襲、轉移中起到相關作用。miR-200c在胰腺癌中發揮著抑癌基因作用，通過靶向調控下游基因及調控相關信號通路來抑制胰腺癌的浸潤與轉移，并可作為評估預后的有效分子標志物，輔助臨床診斷。

隨著技術手段的不斷提高，對miRNA的研究也逐漸從基礎方向至臨床應用方向轉化，越來越多的研究關注到非病毒載體介導的miRNA運載在胰腺癌治療中的應用。但是，miR-200c是否可以作為腫瘤治療劑仍需進一步體內動物實驗及臨床試驗證實。miR-200c與傳統腫瘤治療手段的關系及與其他miRNA間的相互作用關系或成為下一步臨床研究的重點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張堯負責文獻整理，撰寫論文；張鍇、康鵬東參與查閱文獻，修改論文；馬超負責擬定寫作方向，指導撰寫文章并最終定稿。