緊密連接蛋白在非小細胞肺癌中的研究進展

陳 琪，何明旭，韓麗萍

(1.濟寧醫學院 臨床醫學院，山東 濟寧 272000；2.濟寧市第一人民醫院 呼吸與危重癥醫學科，山東 濟寧 272000)

非小細胞肺癌是最常見的最致命的原發性肺部惡性腫瘤，占所有肺癌患者的85%，且通常在晚期確診[1]。在非小細胞肺癌中，腺癌是最常見的亞型，其次是鱗狀細胞癌(鱗癌)[2]。盡管目前非小細胞肺癌在手術、化療和靶向分子治療方面取得了一定的進展，但其預后仍較差，而癌細胞轉移是影響治療效果的重要原因之一。非小細胞肺癌來源于上皮，上皮細胞間緊密連接完整性的破壞將導致細胞間的黏附性喪失和細胞分化障礙，引起細胞增殖失控，從而導致腫瘤侵襲性增加。緊密連接蛋白(Claudins)是緊密連接的重要組成部分，決定著屏障性質、細胞極性和細胞旁通透性。雖然Claudins在腫瘤細胞中的許多功能尚未闡明，但目前研究認為，Claudins在非小細胞肺癌發生、侵襲和轉移中發揮著重要作用。本文就Claudin-1、Clauidn-3、Clauidn-6、Clauidn-7在非小細胞肺癌中的研究進展進行綜述，旨在進一步明確Claudins在非小細胞肺癌中的作用，為非小細胞肺癌的基礎研究及臨床治療提供依據。

1 緊密連接

緊密連接是位于上皮細胞和內皮細胞頂端的細胞間黏附結構，主要存在于上皮細胞、 內皮細胞間的連接復合體中。緊密連接由3種完整的跨膜蛋白(Claudins、連接黏附分子、閉鎖蛋白)和閉合小環蛋白(ZO-1、ZO-2和 ZO-3[3]等外周胞漿蛋白組成，其中跨膜蛋白介導細胞間的接觸，外周胞漿蛋白連接跨膜蛋白與細胞骨架。緊密連接的屏障功能可調節細胞外電荷的選擇性和溶質滲透性，從而維持體內液體和電解質的平衡[4]。除了屏障功能外，緊密連接還具有柵欄功能，將細胞膜的頂端與其他區域隔開，從而阻止頂端和基底外側細胞膜之間的膜蛋白相互混合，參與細胞極性的形成[5]。

2 Claudins概述

目前在哺乳動物中，Claudins家族包括27個成員, 是緊密連接中最重要的結構和功能成分，以組織和(或)細胞特異性的方式表達。Claudins家族成員之間具有相似的結構：在細胞質中的N-端和C-端4個跨膜結構域之間有2個細胞外環(EL1和EL2)，內部跨膜結構域之間有1個短的、由20個殘基構成的細胞內環[6]。第一個細胞外環由約53個氨基酸組成，影響細胞外電荷的選擇性；第二個細胞外環只有約24個氨基酸組成，比第一個細胞外環要小得多，是產氣莢膜梭菌腸毒素的受體。細胞外環是維持緊密連接功能和上皮屏障完整性所必需的，其羧基末端與信號轉導有關[7]。Claudins在調節上皮細胞通透性及維持細胞極性等方面發揮重要作用[8]。此外，Claudins還與多種與細胞增殖和分化相關的信號通路有關[9]。

3 Claudins與非小細胞肺癌

Claudins的丟失以組織依賴的方式導致細胞連接缺失，故被認為在腫瘤進展(以癌細胞的增殖、侵襲和轉移為特征)中發揮重要作用。具體機制為:①Claudins異常表達引起緊密連接紊亂和滲漏，有利于腫瘤的轉移和侵襲;②細胞極性的降低增加了腫瘤的營養和生長因子供應，使腫瘤細胞的增殖加快;③細胞間黏附的減少可能會增加轉移風險并促進腫瘤的侵襲[10]。Claudins家族在相鄰細胞間形成同源和異源的相互作用，是腫瘤發生和轉移的關鍵調控因子。近年來研究表明，Claudins的異常表達與非小細胞肺癌的發生、進展和預后密切相關，可作為判斷非小細胞肺癌診斷、治療及預后的潛在標記物[11]。在非小細胞肺癌中，Claudins的表達不同，作用也不盡相同。

3.1Claudin-1與非小細胞肺癌 Claudin-1分布廣泛，尤其高表達于肝臟、腎臟、皮膚等組織中，在上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程中起重要作用[12]。

Claudin-1在非小細胞肺癌細胞的侵襲、遷移和轉移中發揮了重要作用，受到相關學者廣泛研究。有研究通過芯片分析發現，Clauidn-1 過表達增加了侵襲抑制因子(結締組織生長因子、血小板反應蛋白1等)的表達，敲除外源性或內源性Claudin-1增加了腫瘤的侵襲和遷移能力，使患者的生存期縮短[13]，推測Claudin-1可能是肺腺癌患者預后的有力預測因子。一項納入344例肺癌患者的研究發現，非小細胞肺癌患者Clauidn-1和Clauidn-7的表達均明顯降低，生存時間較短的肺腺癌患者Clauidn-1表達較低[14]。Clauidn-1的過表達抑制了癌細胞的遷移、侵襲和轉移。Zhang等[15]對81例肺腺癌患者進行研究發現，Claudin-1受C-fos(癌基因)信號通路的調控，從而抑制腫瘤的侵襲和轉移，Clauidn-1過度表達預示著肺腺癌患者的總體生存預后良好。Clauidn-1通過抑制細胞外調節蛋白激酶1/2信號通路來抑制鋅指轉錄因子的表達，從而抑制肺腺癌細胞的遷移和轉移[16]。Pyo等[17]進行的meta分析顯示, Clauidn-1低表達與非小細胞肺癌預后不良顯著相關，與腺癌顯著相關，但與鱗癌無顯著相關性。另一方面，Sun等[18]使用免疫組化技術檢測了258例肺腺癌患者組織中Claudin-1的表達情況發現，在大鼠肉瘤和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路的調節作用下，Claudin-1表達陽性患者的預后比Claudin-1表達陰性的患者更差。目前關于Claudin-1對非小細胞肺癌患者診斷與預后的影響尚無統一定論，可能與入組患者在組織學亞型、腫瘤分期和吸煙史方面的差異相關。

3.2Claudin-3與非小細胞肺癌 Claudin-3是Clauidns家族的一員，又稱產氣莢膜梭菌腸毒素受體2，由CLDN-3基因編碼，位于第7號染色體上[19]。 Claudin-3與產氣莢膜梭菌腸毒素結合導致細胞快速裂解，而產氣莢膜梭菌腸毒素能夠有效地抑制 Claudin-3表達陽性的惡性腫瘤[20]。

Che等[20]對103例肺鱗癌術后患者進行回顧性分析發現，Claudin-3通過E-鈣黏蛋白和β-連環蛋白信號通路調控細胞間的相互作用，抑制腫瘤細胞的轉移，是肺鱗癌術后患者預后的獨立危險因素。此外，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR )和免疫蛋白印跡方法檢測Claudin-3在肺鱗癌組織和細胞中的表達，結果發現，Claudin-3在肺鱗癌組織中表達明顯低于正常肺組織，Claudin-3異位過表達顯著抑制肺鱗癌細胞株(H520)的遷移、侵襲和EMT[21]。有研究發現，Claudin-3在腺癌組織中表達增加與患者癌癥進展、生存期縮短均相關(P=0.041和0.029)[22]。Ma等[19]對非鱗狀非小細胞肺癌細胞株(H460、H1792、H157、H292和A549)進行研究發現，Claudin-3在雌激素受體α的調控下發揮促癌調節作用，促進腫瘤的侵襲。

Claudin-3在鱗癌中低表達，過表達Claudin-3的肺鱗癌患者預后較好；而Claudin-3在腺癌患者中高表達，低表達Claudin-3的腺癌患者預后較好。Claudin-3可作為區分肺腺癌和鱗癌的生物學標志物，并作為治療的靶點。

3.3Claudin-6與非小細胞肺癌 Claudin-6是極化上皮和內皮細胞Claudins的重要組成部分之一，在維持細胞完整性方面起著至關重要的作用，可參與調節表皮屏障并保持上皮通透性[23]。Claudin-6是唯一具有潛在特異性的Claudins，它可以激活細胞黏附信號，調節核受體的活性, 其異常表達還與腫瘤細胞的生長和侵襲有關[10]。既往研究表明，Claudin-6在胎兒胃、胰腺、肺、腎等組織中高表達，但在健康成人組織中不表達[24]。Claudin-6已被證實在子宮內膜癌、食管鱗癌、胃癌等多種癌癥中差異表達，并參與發病[10, 25]。近年來Claudin-6在非小細胞肺癌中的作用得到了廣泛關注，其研究并正在進行中。

有研究發現，Claudin-6在各種人類實體癌(如睪丸癌、卵巢癌、子宮癌和肺腺癌等)組織中高表達[26]，認為Claudin-6是一種嚴格的癌胚細胞表面抗原，僅在腫瘤組織中表達。Micke等[27]發現Claudin-6高表達與肺腺癌患者的預后不良相關。Claudin-6在包括肺腺癌和鱗癌在內的大多數惡性腫瘤中表達上調，作為促癌基因，促進腫瘤的遷移和侵襲[28]。另有研究發現，Claudin-6在非小細胞肺癌細胞中呈陽性，但在正常肺細胞和支氣管上皮細胞中呈陰性，Claudin-6的表達與淋巴結轉移和腫瘤分期(tumour-node-metastasis，TNM)相關[10]。但是，Wang等[29]研究發現Claudin-6在非小細胞肺癌組織中的低表達率明顯高于周圍非腫瘤組織，相對于對照組，低表達Claudin-6的非小細胞肺癌患者的腫瘤分期較晚，更容易發生淋巴結轉移，生存率更低、預后更差。

關于Claudin-6在非小細胞肺癌患者中的臨床意義存在爭議，導致研究結論不一致甚至矛盾的原因有很多，包括實驗標本的選擇、單克隆抗體的使用、不同的實驗方法和對結果的解釋等，所以需要更多可靠研究得出更有說服力的結果。

3.4Claudin-7與非小細胞肺癌 Claudin-7廣泛分布于胃、腸道、肺、腎臟、膀胱和皮膚，與通常只位于腸上皮細胞頂部的其他Claudins不同，Claudin-7具有獨特的細胞分布特征，它不僅分布于腸頂端上皮細胞，還高表達于腸上皮細胞側面和基底部[30]。Claudin-7的異常表達導致緊密連接的破壞、細胞接觸抑制的喪失、增殖和遷移的異常，并與非小細胞肺癌的發生、發展密切相關。

Akizuki等[31]通過半定量PCR和qRT-PCR檢測肺鱗癌Claudin-5，Claudin-7，Claudin-18 的表達水平發現，上述Claudins在肺鱗癌中的表達水平明顯低于正常組織，并且Claudin-5，Claudin-7和Claudin-18通過抑制蛋白激酶B的磷酸化，從而抑制人肺鱗癌細胞的增殖。Lu等[32]通過免疫共定位和免疫共沉淀法證實，Claudin-7在人肺癌細胞中與整合素β-1共定位并形成蛋白質復合體，抑制肺癌細胞增殖。敲除Claudin-7不僅促進了腫瘤細胞的增殖，而且破壞了整合素β-1的定位。一項對非小細胞肺癌細胞系(HCC827)的研究證實，在包括肺腺癌在內的各種癌細胞和組織中，Claudin-7通過與整合素β-1的調節作用，維持肺腺癌細胞系的上皮細胞附著，從而抑制肺腺癌細胞增殖[33]。Claudin-7在肺癌組織中低表達，是一種潛在的抗癌蛋白，敲除Claudin-7，非小細胞肺癌細胞的侵襲性增加[34]。Claudin-7在正常組織中的表達高于肺癌組織, 表達水平越高，肺癌細胞分化程度越高(P<0.05)[35]，提示Claudin-7的表達抑制肺癌進展。

Claudin-7是潛在的抑癌基因，Claudin-7的低表達與非小細胞肺癌患者的不良預后緊密相關，可作為診斷和預后的標記物。

4 Claudins與非小細胞肺癌的治療

Claudins是肺癌細胞中EMT的誘導物，而EMT負責癌細胞的侵襲和轉移[36]。越來越多的證據表明，Claudins與EMT、癌癥干細胞的形成、對臨床常規化療藥物的耐藥性相關[6]。研究表明，分化細胞可通過EMT過程產生具有干細胞特征的細胞，因此EMT和腫瘤干細胞之間的軸可能是非小細胞肺癌的有利治療靶點[11]。Claudins介導的信號傳導功能的失調是癌癥的危險因素，Claudins通過與許多其他信號分子的相互作用，參與了非小細胞肺癌的轉移，涉及不同的信號通路，可為將來非小細胞肺癌的靶向治療提供更多的靶點[37]。

5 小結

Claudins作為細胞間緊密連接的重要參與者，它在非小細胞肺癌中表達的失調與非小細胞肺癌的發生、惡性程度、局部復發和遠處轉移密切相關。在不同非小細胞肺癌病理類型中，Claudins家族的表達也不盡相同，目前Claudins的功能特點、調控機制、與其他緊密連接成員的相互作用及促進非小細胞肺癌侵襲、遷移和轉移的具體機制仍在研究當中。隨著研究的進一步深入，Claudins作為生物標記物和治療靶點在非小細胞肺癌的臨床診治中會有更加廣泛的應用。