基于網絡藥理學及體內實驗探討溫腎通絡止痛方對原發性骨質疏松癥小鼠MAPK信號通路的調節作用

韓秋革，員浬，劉孟敏?，郭楊，馬勇，孫杰，王禮寧，潘婭嵐

（1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫藥大學骨傷修復與重建新技術實驗室，江蘇 南京 210023）

原發性骨質疏松癥（primary osteoporosis，POP）是一種以低骨量、骨組織退化和骨微結構破壞為特征，由多種病因引起的骨代謝障礙類疾病，它會導致骨強度受損并且增加骨折的風險［1］。全球骨質疏松癥患者已超過2 億，病發率超過25%［2］，已成為嚴重影響人們身體健康的慢性疾病之一。目前，治療骨質疏松癥的藥物主要有兩大類：一是促進骨形成的藥物，如雙膦酸鹽、雌激素、降鈣素等；二是抑制骨吸收的藥物，如甲狀旁腺激素、合成類固醇等。盡管這些藥物均在治療骨質疏松方面發揮一定療效，但都存在著不良反應［3-6］。

中醫學認為，POP 屬本虛標實之證，病位在腎，本虛以腎為主，涉及肝陰、脾氣和氣血不足；標實多為氣滯血瘀。基于此，馬勇等提出在治療上應以補腎通絡為主，兼以益氣化瘀、活血通絡［7］。溫腎通絡止痛方具有溫陽、通絡、除痹、止痛等功效，已在江蘇省中醫院應用十余年，臨床療效較好［8］。課題組已申請發明專利［9］（申請公布號：CN 107823493 A），并建立了溫腎通絡止痛方質量控制方法［10］，且研究發現該方能夠明顯增加去卵巢大鼠血清生化指標OPG/RANKL 比值，抑制破骨細胞活性，促進脂肪細胞分泌外泌體，影響骨髓內BMSC 的成骨與成脂分化，發揮抗骨質疏松作用［7，10］。但該復方組分較多，作用機制尚不明確。基于此，本研究采用網絡藥理學的方法，通過建立“溫腎通絡止痛方-活性成分-交集靶點-通路-原發性骨質疏松癥”關系，挖掘其潛在的分子作用機制并進行驗證，以期為POP的治療及后續研究提供依據。

1 網絡藥理學

1.1 溫腎通絡止痛方活性成分及其潛在靶點的篩選

分別以“附子”“山茱萸”“骨碎補”“淫羊藿”“蛇床子”“薏苡仁”“獨活”“羌活”“白芍”“白術”“細辛”“甘草”為關鍵詞，利用TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw. com/tcmsp. php）檢索各味中藥的活性成分，借助人體藥物代謝動力學參數ADME預測篩選，設定參數生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18；利用TCMID（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http：//119.3.41.228：8 000/tcmid/）與BATMANTCM 數據庫（http：//bionet. ncpsb. org/batman-tcm/）篩選出狗脊與天麻活性成分及其相關靶點。利用Uniprot將靶點名稱標準化。

1.2 原發性骨質疏松癥潛在靶點的及藥物和疾病交集靶點的獲取

以“primary osteoporosis”為關鍵詞，檢索OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//www. omim. org/）和GeneCards（https：//www. genecards.org/）數據庫，設置GeneCards 中相關性分數≥6，整合、去重后靶點即為原發性骨質疏松癥潛在靶點。利用R語言VennDiagram 數據包獲取藥物與疾病潛在靶點的交集。

1.3 構建溫腎通絡止痛方防治原發性骨質疏松癥網絡關系圖與PPI網絡視圖

建立復方、藥物活性成分以及藥物與疾病交集靶點信息文件，將其導入Cytoscape 3.7.2繪制“溫腎通絡止痛方-活性成分-交集靶點-原發性骨質疏松癥”網絡視圖，并進行網絡拓撲學分析。將藥物與疾病交集靶點輸入至在線數據庫STRING 中，選擇種屬信息為“Homo sapiens”，設置置信度為0.4，獲得“stringinteraction. tsv”文件。將其導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，進行網絡拓撲學分析，設定度值（Degree）≥50（度值中位數2倍），篩選核心靶點，并繪制網絡圖。

1.4 基因本體論和通路富集分析

將藥物與疾病交集靶點輸入至DAVID 數據庫中，選擇種屬信息“Homo Sapiens”，選擇GO 富集過程中的生物學過程（biological process，BP）、細胞組成（celluar components，CC）與分子生物學功能（molecular function，MF）以及KEGG 通路，篩選具有統計學意義（P＜0.05）的條目，利用微生信在線網站繪圖，并進行分析。

2 驗證實驗

2.1 材料與儀器

SPF 級雌性C57BL/6J小鼠21只，體質量（18±2）g，由南京市青龍山動物繁殖場提供，動物合格證號：SCXK（浙）2019-0002。動物購進后飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，適應性飼養1 周后進行實驗，SPF 級條件常規喂養，12 h/12 h 光暗交替，恒溫、恒濕，動物自由攝取飼料和飲用水。本項目動物實驗方案經南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查通過（批準號：202107A006）。

蘇木素-伊紅（HE）染液（南京建成生物工程研究所，批號：D006-1-1）；JNK（CST #9252）、p-JNK（abcam ab76572），ERK、p-ERK 抗體、內參抗體GAPDH、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（美國Proteintech公司，批號分別為11257-1-AP、28733-1-AP、18165-1-AP、SA00001-2）；總RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號分別為RC101-01、R223-01、Q711-02）；非變性組織/細胞裂解液（北京Solarbio 公司，批號：R0030）；IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（南京金益柏生物科技有限公司，批號分別為LA128802H、LA1288 01H）。

Allsheng 型全自動多功能酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司）；VE-180型垂直電泳槽、凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；MAX-TL 型高速冷凍離心機（美國BeckMan 公司）；SCIENTZ-950E 型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技公司）；DM1000 型生物顯微鏡（德國Leica 公司）；mini Trans-blot cell 型電轉印槽系列（美國BioRad 公司）；QuantStudio3 型Realtime PCR 儀（美國ABI 公司）；5200CE 型全自動化學發光圖像分析系統（中國Tanon 公司）；Mastercycler nexus型PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；Nano-300 型微量分光光度計（山東萊索科技有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 實驗藥物及制備

溫腎通絡止痛方由附子8 g、山茱萸10 g、骨碎補30 g、淫羊藿10 g、蛇床子15 g、狗脊10 g、薏苡仁15 g、炒白術10 g、羌活10 g、獨活10 g、細辛3 g、天麻6 g、白芍15 g 和炙甘草6 g 組成。實驗所用藥物均購于江蘇省中醫院，經南京中醫藥大學吳德康教授鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》的規定。按配伍比例取溫腎通絡止痛方飲片，加入10 倍量的水煎煮1 h。煎煮的藥渣再次加入8 倍量的水煎煮1 h。兩次提取的藥液合并后過濾，濾液通過旋蒸儀減壓濃縮至2 g/mL，4 ℃保存備用。

2.2.2 去卵巢骨質疏松癥動物模型制備

21 只SPF 級C57BL/6J 雌性小鼠適應性飼養1 周后，隨機分為假手術組（7 只）和造模組（14 只）。假手術組切除卵巢周圍相等質量的脂肪組織，造模組均切除雙側卵巢。于術后1 周小鼠情況穩定后開始連續給藥8 周。術后各組小鼠均在相同條件下飼養，自由飲水攝食。

2.2.3 分組及給藥

將造模組（14只）隨機分為模型組（7只）與溫腎通絡止痛方組（7只），根據人與小鼠體表面積換算法［11］確定小鼠給藥劑量為22 g/kg。給藥灌胃體積為15 mL/kg，假手術組與模型組給予同等體積生理鹽水。連續給藥8周。

2.3 觀測指標

2.3.1 HE染色法觀察股骨組織形態學變化情況

采集股骨組織，放置4%多聚甲醛中固定24 h 后將其轉移至10%EDTA 脫鈣液中脫鈣4 周。二甲苯溶液透明，常規石蠟包埋。切取5 μm 厚的薄片后，蘇木素染色，1%鹽酸-乙醇分化，1%氨水反藍，伊紅染色，中性樹脂封片，在倒置顯微鏡下觀察骨組織的病理結構。

2.3.2 ELISA法檢測小鼠血清IL-6、TNF-α水平

所得血清按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟檢測IL-6、TNF-α的表達水平。

2.3.3 Real-time PCR 法檢測脛骨組織中相關mRNA表達

取骨組織20 mg，液氮下充分研磨至粉末，使用離心柱提法取骨組織提取總RNA，提取的總RNA 首先去除基因組中的DNA，然后進行反轉錄，引物序列見表1。以上步驟均按照產品說明書進行操作。并按諾唯贊試劑盒說明擴增cDNA。使用2-ΔΔct方法計算mRNA 的相對表達量。

表1 PCR引物序列

2.3.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測脛骨組織中蛋白表達

提取小鼠脛骨組織中總蛋白，BCA測定蛋白含量。BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度。后續進行電泳，轉膜，5%奶粉封閉2 h，一抗ERK（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）4 ℃過夜，洗膜后分別加入對應的二抗（1∶10 000，室溫孵育2 h，ECL上機顯影，使用Image J軟件對圖像進行灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值表示蛋白相對表達量并進行統計分析。

2.4 統計學分析

采用SPSS 19.0 對實驗數據進行統計分析，計量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析（oneway ANOVA），組間兩兩比較采用 Student-NewmanKeuls（SNK）檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 網絡藥理學結果

3.1.1 溫腎通絡止痛方防治原發性骨質疏松癥的活性成分與靶點的篩選結果

經TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM 數據庫檢索并篩選后，發現溫腎通絡止痛方防治原發性骨質疏松癥活性成分共203 個。其中附子3 個，山茱萸6 個，骨碎補12個，淫羊藿17個，蛇床子11個，狗脊19個，羌活7個，獨活5個，細辛4個，薏苡仁4個，炒白術3個，白芍13個，炙甘草83個，天麻16個。溫腎通絡止痛方中各味中藥重復成分信息見表2。

表2 溫腎通絡止痛方各味中藥中重復成分信息

通過GeneCards 與OMIM 數據庫檢索、篩選、去重后共獲得1 817 個疾病靶點，其中GeneCards 數據庫中篩選相關性分數≥6 的疾病靶點共1 428 個，OMIM 數據庫中共389 個。利用R 語言VennDiagram 數據包篩選獲得藥物與疾病交集靶點共154個。

3.1.2 溫腎通絡止痛方防治原發性骨質疏松癥網絡關系圖

利用Cytoscape 3.7.2繪制“溫腎通絡止痛方-活性成分-交集靶點-原發性骨質疏松癥”網絡視圖，共有329 個節點（包括復方與疾病名稱，173 個活性成分，154個靶標基因），1 175條邊，網絡密度為0.018，網絡異質性為2.681。除復方和疾病節點外，該網絡圖度值平均值為6.2，其中29個靶標基因、18個活性成分大于度值平均值，靶標基因中ESR1的節點度最高，其次為AR、PPARG、ESR2等。活性成分中山柰酚的節點度最高，其次為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素等。見圖1。

圖1 溫腎通絡止痛方-活性成分-交集靶點-原發性骨質疏松癥網絡視圖

3.1.3 PPI網絡視圖構建

利用STRING 在線數據庫分析藥物與疾病交集靶點，并利用插件Network Analyzer進行網絡拓撲學分析。PPI 網絡中共153 個節點（置信度≥0.4），2 196 條邊。核心靶點網絡圖中共有25個節點，282條邊，見圖2。按照度值由高到低核心靶標基因包括INS、GAPDH、AKT1、IL6等，見表3。度值越大表示與溫腎通絡止痛方防治原發性骨質疏松癥的關系越緊密。

表3 核心靶點信息

圖2 PPI網絡圖節點拓撲篩選過程

3.1.4 基因本體論與通路富集分析

GO 富集分析結果表明具有統計學意義的功能注釋過程共646個。其中分子生物學功能（MF）有104個條目，細胞組成（CC）有63 個條目，生物學過程（BP）有479 個條目，見圖3。BP 占較大比例，發揮主要作用（圖3A）。按照P值由小到大排列，對BP、CC、MF前十位注釋過程進行作圖（圖3B），并對BP 前20 個功能注釋過程繪制條形圖（圖3C），顏色越淺表示P值越小，各生物學過程差異越顯著；條形長度越長表示富集在此過程的基因數目越多。

在KEGG 富集分析中，共有90 條差異具有統計學意義（P＜0.05）的信號通路。其中65條信號通路具有顯著性差異，共有32 條通路與原發性骨質疏松癥有關。包括PI3K/Akt、TNF 信號通路、MAPK 信號通路等。并將其按照P值由小到大進行排列，對前二十條通路繪制氣泡圖（圖3D）。圖3D 中圓的顏色越深表示P值越小，通路差異越顯著，圓的直徑越大表示富集在這一通路上的基因數目越多。

圖3 GO與KEGG分析

3.2 溫腎通絡止痛方對原發性骨質疏松癥小鼠的作用

3.2.1 HE染色結果比較

假手術組小鼠股骨骨小梁形態完整，排列緊密規整，小梁間連接呈網狀，骨髓腔較小，骨髓細胞數量豐富。模型組小鼠骨小梁形態結構稀疏，數量明顯減少，排列紊亂，骨髓腔變大。溫腎通絡止痛方組小鼠骨小梁結構較前完整，數量增多，排列尚規則，連續完整性較好，骨小梁間隙略有增大。見圖4。

圖4 各組小鼠股骨組織HE染色圖（×100）

3.2.2 ELISA檢測IL-6、TNF-α表達水平

與假手術組比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α 表達水平明顯升高（P＜0.01），溫腎通絡止痛方可降低模型組小鼠IL-6、TNF-α 的表達水平（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α表達水平的比較（±s，n=3）

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α表達水平的比較（±s，n=3）

注：與假手術組比較，2）P ＜0.01；與模型組比較，4）P ＜0.01。

組別假手術組模型組溫腎通絡止痛方組TNF-α（pg/mL）261.41±6.80 658.42±9.562）245.36±6.014）劑量——22 g/kg IL-6（pg/mL）65.89±4.60 110.58±4.182）81.66±4.154）

3.2.3 qPCR檢測IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA的水平

與假手術組比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α mRNA水平升高（P＜0.01），Runx2 mRNA水平降低（P＜0.01）；溫腎通絡止痛方能夠降低模型組小鼠IL-6、TNF-α mRNA 水平（P＜0.01），升高Runx2 mRNA 表達水平（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA表達水平的比較（±s，n=3）

表5 各組小鼠IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA表達水平的比較（±s，n=3）

注：與假手術組比較，2）P ＜0.01；與模型組比較，4）P ＜0.01。

Runx2 1.00±0.10 0.45±0.042）0.72±0.014）組別假手術組模型組溫腎通絡止痛方組劑量——22 g/kg IL-6 1.00±0.10 9.99±0.292）8.46±0.674）TNF-α 1.00±0.13 12.21±0.302）11.08±0.164）

3.2.4 Western blot 法檢測小鼠脛骨組織中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表達水平

與假手術組比較，模型組p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 相對表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01），溫腎通絡止痛方可降低模型組小鼠p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表達水平。見表6，圖5。

圖5 各組小鼠ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達電泳圖

表6 各組小鼠脛骨ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達的比較（±s，n=3）

表6 各組小鼠脛骨ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達的比較（±s，n=3）

注：與假手術組比較，2）P ＜0.01；與模型組比較，3）P ＜0.05，4）P ＜0.01。

組別假手術組模型組溫腎通絡止痛方組p-ERK/ERK 0.98±0.03 1.18±0.042）1.09±0.023）劑量——22 g/kg p-JNK/GAPDH 0.69±0.00 1.27±0.012）0.85±0.004）JNK/GAPDH 0.32±0.00 0.34±0.002）0.32±0.003）p-JNK/JNK 2.12±0.01 3.75±0.042）2.71±0.024）p-ERK/GAPDH 1.44±0.44 2.22±0.072）1.68±0.044）ERK/GAPDH 1.54±0.03 1.88±0.442）1.48±0.034）

4 討論

原發性骨質疏松癥是現代臨床中常見的骨科疾病，歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，《黃帝內經》載：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長……七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。丈夫八歲，腎氣實，發長齒更……七八，肝氣衰，筋不能動，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極”［12］。

本研究通過網絡藥理學方法對溫腎通絡止痛方治療原發性骨質疏松癥的潛在作用機制進行探究，共篩選出203個活性成分與154個靶標基因，其中活性成分主要為山柰酚、槲皮素、木犀草素等，靶標基因主要為IL-6、TNF-α 等。山柰酚能夠調節Ca2+代謝平衡，升高Ⅰ型原膠原羥基端延長肽（PICP），降低Ⅰ型膠原C端肽（ICTP）水平，促進骨膠原生成，減少骨小梁丟失，起到對卵巢去勢大鼠的治療作用［13］。槲皮素能夠使去卵巢骨質疏松癥組大鼠血液中CTX、TRACP-5b 含量顯著降低，有效抑制破骨分化，改善骨質疏松癥［14］。木犀草素通過抑制ATF2，p38 MAPK 和NFATc1 的表達來抑制RANKL誘導的破骨細胞生成，發揮抗骨質疏松作用［15］。

炎性因子IL-6、TNF-α 等在原發性骨質疏松癥中扮演著重要的角色［16］。在骨微環境中有許多細胞能夠產生IL-6，包括成骨細胞、破骨細胞和巨噬細胞等。IL-6 缺失小鼠表現出卵巢切除誘導的骨丟失和破骨細胞形成減少［17］。TNF-α 被認為是最強的抗腫瘤因子。各種類型的細胞均可產生TNF-α，包括巨噬細胞、NK細胞、肥大細胞等。TNF-α在分化的某些階段能抑制成骨細胞的活性，并刺激破骨細胞的增殖和分化，促進造血干細胞向破骨細胞分化，增加巨噬細胞中RANK 和RANKL 水平，從而激活多個靶點如MAPK、TRAF2、JNK、NF-κB，介導破骨細胞的增殖和分化的因子［18］。本實驗結果顯示，在小鼠切除卵巢后血清中IL-6、TNF-α 的表達水平以及脛骨組織中IL-6、TNF-α的mRNA的表達水平顯著升高，由此提示雌激素能夠抑制IL-6、TNF-α的表達水平。本研究表明，溫腎通絡止痛方可抑制IL-6、TNF-α的表達，此外，溫腎通絡止痛方組TNF-α 的表達水平與假手術組表達水平相當，甚至更低，這表明去卵巢小鼠血清中TNF-α的升高不僅來源于手術應激，還來源于去卵巢引發的骨代謝失衡。溫腎通絡止痛方不僅可以糾正骨代謝失衡，還能減輕手術導致的炎癥反應，這體現了中藥多靶點治療的特點，并可以為后續研究提供一個新的方向。

KEGG 富集分析可知，與POP 相關的信號通路主要有PI3K/Akt 信號通路、MAPK 信號通路與破骨細胞分化等。PI3K/Akt信號通路是細胞增殖、轉移、黏附及死亡過程中的重要調節者，在正常的生理條件下，PI3K/Akt 信號通路能夠選擇性地影響成骨、破骨細胞的生理功能，維持骨組織的動態平衡。研究表明，調控PI3K/Akt 信號通路能夠促進骨髓基質細胞的增殖，阻止炎癥的發生和發展，促使骨礦化，提高骨生物力學，減輕絕經后骨質疏松癥的臨床癥狀［19-20］。MAPKs通路能夠調控從增殖分化到細胞凋亡等多種過程，積極參與免疫防御和炎癥反應，該通路主要有Erk1/2、p38 和JNK 三條途徑［21］。通過MAPK 激活將細胞外刺激信號傳遞給適當的細胞內分子已被證實是調節破骨細胞分化和骨重建所必需的過程。破骨細胞階段阻斷JNK活性導致TRAP陽性細胞逆轉為TRAP陰性細胞（代表破骨細胞前體），即使在持續存在RANKL 的情況下也是如此，說明JNK 途徑是維持破骨細胞分化所必需的過程，直至融合［22］。有研究表明可通過抑制MAPK 信號通路抑制其下游因子NFATC1和c-fos，并促進成骨相關因子Runx2等的表達發揮抗骨質疏松作用［23］。本實驗通過免疫蛋白印跡方法檢測p-JNK、JNK、p-ERK、ERK 的蛋白表達，結果顯示溫腎通絡止痛方能夠降低p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 的相對表達。這也提示溫腎通絡止痛方能夠通過調節TNF-α、IL-6 因子，激活MAPK 信號通路，影響炎癥反應治療骨質疏松癥。此外，本實驗也通過HE 染色與qPCR 檢測，發現溫腎通絡止痛方能夠增加POP 小鼠骨小梁，使其排列較為規整且致密，骨髓細胞較模型組增加，骨髓腔間隙減小，升高Runx2 的mRNA 表達，證明該復方具有抗POP的作用。

綜上所述，溫腎通絡止痛方可通過多成分、多靶點、多通路的方式來調控骨代謝，維持機體骨穩態，并通過降低IL-6、TNF-α的表達水平，調節MAPK信號通路影響炎癥反應等過程，從而調節骨穩態，發揮治療作用。本研究利用網絡藥理學與實驗驗證，為原發性骨質疏松癥的治療及溫腎通絡止痛方防治原發性骨質疏松癥的后續深入研究提供了科學依據。