益腎通絡(luò)方對(duì)雌性小鼠卵子修復(fù)精子DNA能力的影響

趙莉娜，門波，陳建設(shè)，孫自學(xué)，張宸銘

（1. 河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046）

精子在生成、形成和成熟過(guò)程中，由于主要細(xì)胞器的脫落失去了DNA 損傷修復(fù)系統(tǒng)。因此，精子在成熟后不具備自我修復(fù)的能力，成熟的精子必須依靠卵母細(xì)胞中的修復(fù)系統(tǒng)來(lái)修復(fù)DNA損傷［1］。而卵母細(xì)胞的修復(fù)能力根據(jù)個(gè)體、年齡的不同呈現(xiàn)較大差異［2］。尤其是高齡女性會(huì)出現(xiàn)妊娠率低、流產(chǎn)率高等情況，這可能與卵子DNA修復(fù)功能密切相關(guān)［3］。

益腎通絡(luò)方是本課題組前期臨床使用近二十年的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)于該方在改善精子質(zhì)量方面，尤其是改善精子DNA 完整性方面的作用，做了大量的基礎(chǔ)研究工作［4-7］，發(fā)現(xiàn)該方能夠有效降低患者精子DNA 的碎片率，且安全性較高［8-9］。近年來(lái)，隨著二胎、三胎政策的放開(kāi)，高齡患者的就診量明顯上升。課題組根據(jù)中醫(yī)“異病同治”理論，將該方應(yīng)用于高齡女性患者，發(fā)現(xiàn)其可明顯增加患者妊娠率、活產(chǎn)率，但具體機(jī)制不明。本研究通過(guò)復(fù)制苯并（a）芘（BaP）致雄鼠精子DNA 損傷模型，使正常雄鼠及BaP 染毒雄鼠分別與灌胃益腎通絡(luò)方水煎液及灌胃生理鹽水的雌鼠合籠，對(duì)比各組雌鼠的妊娠結(jié)局，探討益腎通絡(luò)方改善雌鼠卵子質(zhì)量的作用機(jī)制。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20 只雄性、30 只雌性SPF ICR（CD1）小鼠（10 周齡，體質(zhì)量30～40 g），購(gòu)買于河南斯克貝斯生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（豫）2020-0005。對(duì)小鼠進(jìn)行編號(hào)，然后依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和操作均已得到河南省中醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)在河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室的獨(dú)立通風(fēng)籠（IVC）系統(tǒng)中，許可證號(hào)：SYXK（豫）2011-0002。IVC 系統(tǒng)中，溫度21～25 ℃，濕度38%～60%，通風(fēng)量為22 次/h，光照/黑暗周期為12 h。小鼠可以自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料和過(guò)濾水。在正式實(shí)驗(yàn)之前，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

益腎通絡(luò)方組成：菟絲子20 g，淫羊藿20 g，黃芪20 g，丹參30 g，熟地黃10 g，牛膝10 g 和水蛭6 g，飲片購(gòu)自河南省中醫(yī)院中藥房，所有藥材均經(jīng)河南省中醫(yī)院制劑中心黃小敏主任藥師鑒定。制備為3 g/mL的藥材水煎液，保存在4 ℃的冰箱中備用。苯并（a）芘（BaP，分析純，純度≥96%）（批號(hào)：C11287800，北京德晟嘉行科技有限公司）；精子核完整性染色試劑盒（批號(hào)：201101，浙江星博生物科技股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

20 只雄性小鼠隨機(jī)分為兩組，每組10 只，分別為A組和B組。A組小鼠（A1～A10）作為雄性空白對(duì)照組，灌胃與B組等量的生理鹽水。B組小鼠（B1～B10）參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行BaP 染毒，染毒劑量為100 mg/（kg·d），共60 d，復(fù)制精子DNA損傷模型作為雄性造模組。同時(shí)，30 只雌性小鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只，分別為C 組（C1～C10）、D 組（D1～D10）和E 組（E1～E10）。C、D 組小鼠作為雌性空白對(duì)照，灌胃與E 組等量的生理鹽水，E 組小鼠按23.78 g/kg 劑量（按照體表面積法［11］計(jì)算的等效劑量）灌胃益腎通絡(luò)方水煎液，共60 d。

灌胃結(jié)束后，采用角化細(xì)胞計(jì)數(shù)法［12］觀察雌鼠動(dòng)情周期。在雌鼠動(dòng)情期時(shí)，將A 組每只雄鼠與編號(hào)相同的C 組雌鼠按照1∶1 比例合籠，一籠2 只，即A1 + C1、A2 + C2……A10 + C10。將B 組每只雄鼠與相同編號(hào)的D 組和E 組雌鼠按照1∶2 比例合籠，一籠3 只，即B1 + D1 + E1、B2 + D2 + E2……B10 +D10 + E10。合籠次日觀察雌鼠陰栓情況［13］，發(fā)現(xiàn)陰栓則記為妊娠0 d，將雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)直至F1 代出生，F(xiàn)1 代出生后統(tǒng)計(jì)每只雌鼠活產(chǎn)數(shù)。具體實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)圖1。

圖1 技術(shù)路線圖

1.4 SCSA法檢測(cè)精子DNA碎片指數(shù)（DFI）

合籠成功后，采用戊巴比妥鈉麻醉雄鼠，解剖后取附睪尾制成精子懸液，采用改良的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測(cè)（SCSA）法［14］檢測(cè)精子DFI。將精子懸液轉(zhuǎn)移到800 μL的冷TNE緩沖液中，通過(guò)100 μm尼龍過(guò)濾器。將過(guò)濾后的精子懸浮液用相同的緩沖液稀釋到（2 × 106～3×106）/mL 的濃度，然后用酸性洗滌劑溶液將100 μL的精子懸液稀釋到200 μL，置于FACS 管中。加入600 μL 吖啶橙染色液，染色30 s。每個(gè)樣本都用BD Accuri?C5流式細(xì)胞儀（BD Pharmingen，San Diego，CA，USA）對(duì)5 000 個(gè)精子進(jìn)行門控分析。使用BD Accuri?C6 plus 軟件（BD Pharmingen）計(jì)算DFI，并根據(jù)單鏈（紅色）和雙鏈（綠色）熒光比例計(jì)算精子DNA 碎片指數(shù)（sperm DNA fragmentation index，DFI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，則兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)于非正態(tài)分布或方差不齊的資料則采用t'檢驗(yàn)。三組比較則采用單因素方差分析（ANOVA），并應(yīng)用LSD 法進(jìn)行各組間進(jìn)行兩兩比較；對(duì)于非正態(tài)分布或方差不齊資料則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

各組小鼠毛發(fā)光澤，活動(dòng)正常，雌鼠動(dòng)情周期規(guī)律。雄鼠造模后未出現(xiàn)明顯的外觀變化。

2.2 兩組雄鼠DFI情況比較

合籠成功后，處死所有雄鼠并取材檢測(cè)DFI。兩組雄鼠DFI 相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.000 ＜0.01），表明造模成功。見(jiàn)表1。

表1 兩組雄鼠DFI比較（±s）

表1 兩組雄鼠DFI比較（±s）

注：與A組比較，*P ＜0.01。

組別雄性空白對(duì)照組（A組）雄性造模組（B組）t值P值DFI（%）4.69±1.48 18.95±4.12**-10.308 0.000 n 10 10

2.3 雌鼠合籠情況比較

與C 組比較，D 組小鼠產(chǎn)仔數(shù)（P= 0.000）及活胎數(shù)（P= 0.000）均顯著降低，死胎率明顯增高（P=0.002）；與D 組比較，E 組產(chǎn)仔數(shù)（P=0.014）及活胎數(shù)（P=0.000）顯著增加。但兩組死胎數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠合籠情況比較（±s）

表2 各組小鼠合籠情況比較（±s）

注：與C 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與D 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

死胎數(shù)0 1.75±1.39**1.00±1.12*組別C組D組E組n989產(chǎn)仔數(shù)9.89±1.90 5.13±2.10**7.56±1.67*△活胎數(shù)9.89±1.90 3.38±0.92**6.56±1.13**△△

3 討論

精子DNA 對(duì)于妊娠而言至關(guān)重要，雖然許多不育患者的精液分析報(bào)告顯示精子活力和濃度正常，但是他們中有近一半患者的精子DNA 碎片率增高［15］。因此，精子DNA 更能夠反映男性生殖能力，預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局。臨床治療中也發(fā)現(xiàn)，與無(wú)相關(guān)病史的男性相比，有反復(fù)自然流產(chǎn)史夫婦中的男性，精子的活動(dòng)率明顯較差，DFI增高［16-18］。當(dāng)精子DFI小于27%時(shí)，受精后卵母細(xì)胞能夠修復(fù)受損的精子DNA，但如果DFI超過(guò)這一數(shù)值，就超過(guò)了卵母細(xì)胞的修復(fù)能力，可能會(huì)出現(xiàn)不孕或自然流產(chǎn)［19］。

女性的孕育能力和其后代的健康在很大程度上依賴于源源不斷的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞。與體細(xì)胞相似，當(dāng)卵母細(xì)胞受到各種內(nèi)外因素，如輻射、污染、炎癥、氧化損傷等影響，出現(xiàn)DNA 損傷后，會(huì)啟動(dòng)DNA 損傷修復(fù)通路，DNA 修復(fù)可能是確保女性生育能力以及將高質(zhì)量的遺傳物質(zhì)傳遞給后代的重要機(jī)制［20］。卵子在形成時(shí)，會(huì)經(jīng)歷染色體解螺旋、復(fù)制、分離等過(guò)程，在這一時(shí)期染色體更容易受到外界因素的影響出現(xiàn)DNA 損傷。而且，隨著年齡的增大［21］、復(fù)制次數(shù)的增加以及外界不明原因的影響，會(huì)導(dǎo)致染色體出現(xiàn)復(fù)制錯(cuò)誤、斷裂、基因片段丟失等情況，最終導(dǎo)致形成的卵子功能不全，甚至出現(xiàn)過(guò)早凋亡，在這期間卵母細(xì)胞的DNA 修復(fù)機(jī)制起著至關(guān)重要的作用［22］。然而，這種能力是有限的，可能隨著年齡的增長(zhǎng)而下降［23］。

目前已經(jīng)有許多關(guān)于中藥修復(fù)精子DNA 的報(bào)道［24］，但未見(jiàn)中藥修復(fù)卵子DNA 的相關(guān)報(bào)道。關(guān)于中藥提高卵子質(zhì)量方面的報(bào)道更為常見(jiàn)，中藥能夠明顯提高卵子的質(zhì)量，減少促排卵時(shí)促性腺激素的使用，提高妊娠率、活產(chǎn)率，改善妊娠結(jié)局［25］。在輔助生育技術(shù)中，中醫(yī)藥同樣也發(fā)揮著重要作用，補(bǔ)腎類中藥能夠改善卵子質(zhì)量、提高受精率、降低不良反應(yīng)及流產(chǎn)率，總體提高輔助生育的成功率［26-27］。目前認(rèn)為卵細(xì)胞中線粒體功能與卵子質(zhì)量密切相關(guān)［28］，經(jīng)典補(bǔ)腎填精中藥方劑毓麟珠可通過(guò)改善卵巢功能不全模型小鼠的線粒體功能提高卵子質(zhì)量［29］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)采用自擬經(jīng)后增殖方（組成：黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎、菟絲子和鹿角霜等）能夠提高超促排卵大鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量，具體機(jī)制可能與提高GDF9、BMP15 和FGF10（分泌因子）的表達(dá)有關(guān)［30］。

通過(guò)臨床觀察并結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，許多不孕癥女性患者常見(jiàn)的臨床證型為腎虛血瘀型，尤其是卵巢功能低下及卵巢早衰患者［31］。眾多醫(yī)家也主要通過(guò)補(bǔ)腎活血法改善患者卵巢功能［32-33］。因此，近年來(lái)課題組將原本改善男性生殖細(xì)胞質(zhì)量的益腎通絡(luò)方應(yīng)用于女性患者，尤其是高齡女性患者，取得了較好的療效。但中醫(yī)藥是如何通過(guò)提高卵母細(xì)胞DNA 修復(fù)能力從而提高妊娠率的機(jī)制尚不明確，本研究為中醫(yī)藥提高卵母細(xì)胞DNA 修復(fù)能力提供初步證據(jù)，但仍需進(jìn)一步探討其確切機(jī)制。

綜上所述，BaP 染毒可造成雄鼠DFI 升高，降低合籠雌鼠妊娠率。益腎通絡(luò)方提前干預(yù)雌鼠可改善其與高DFI雄鼠合籠的妊娠結(jié)局。具體機(jī)制推測(cè)可能與益腎通絡(luò)方改善卵子的DNA修復(fù)能力有關(guān)。