基于神經(jīng)細胞外基質(zhì)探討健脾補土方抗大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細胞失巢凋亡機制

劉祎，劉旺華，3?，李花，彭智遠

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208）

腦卒中是人類心腦血管疾病中最嚴重的疾病之一，其防治是全球性的難題，通過醫(yī)學(xué)干預(yù)恢復(fù)缺血、缺氧后腦組織血液再充氧是其主要治療方式。中國全部卒中事件中缺血性卒中約占所有腦卒中患者的85%［1］。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是一種較嚴重的病理損傷過程，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)細胞自噬與凋亡等病理機制，是缺血性腦卒中損傷加重的主要原因之一［2］。凋亡存在于各類疾病病理過程中，細胞凋亡是主動的程序性死亡，當(dāng)腦缺血再灌注損傷后，神經(jīng)細胞凋亡是神經(jīng)細胞死亡的主要途徑之一［3］。細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）如纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和層粘連蛋白（laminin，LN）等，是細胞和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者，對細胞外平衡的維持較為重要，ECM 環(huán)境中基質(zhì)成分及細胞黏附受體相互結(jié)合，為細胞、組織和器官，甚至整個機體提供支撐作用［4］。當(dāng)細胞脫離ECM環(huán)境，或ECM 受到損傷，細胞會經(jīng)歷一種特殊類型的程序性死亡，稱為失巢凋亡［5］。神經(jīng)ECM 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在生理情況下，ECM 的產(chǎn)生和降解能夠維持機體的動態(tài)平衡，為神經(jīng)細胞提供支持環(huán)境；腦缺血發(fā)生時，平衡狀態(tài)被打破，神經(jīng)細胞失去支撐，從而導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡［6］。因此，神經(jīng)ECM 是神經(jīng)元生存的細胞外環(huán)境和載體，起到承載、營養(yǎng)、保護并促進神經(jīng)元突觸生長的作用，且有利于促進干細胞向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化。神經(jīng)ECM 對神經(jīng)元的作用與中醫(yī)學(xué)“脾屬土，土主承載”功能相似［6］。基于此，本研究擬從“脾”論治，探討以四君子湯為基本方的健脾補土方對腦缺血再灌注后神經(jīng)ECM 的保護作用及抗神經(jīng)細胞失巢凋亡中的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（250±10）g，購于湖南斯萊克景達有限公司，湖南中醫(yī)藥大學(xué)東塘SPF級實驗室飼養(yǎng)，溫度（23±2）℃，相對濕度（45±10）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d后，對體質(zhì)量達（290±10）g的大鼠予以造模。本實驗已獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準，動物試驗許可證號：SYXK（湘）2013-0005，動物合格證號：43004700018445。

1.2 藥物及制備

健脾補土方組成：人參片15 g，白術(shù)12 g，茯苓10 g，黃芪15 g，山藥12 g，薏苡仁12 g 和炙甘草6 g，所需中藥飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)黃小平教授鑒定，符合2015 版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。所有藥材用純水浸泡30 min，首次煎煮用6 倍量水，煎煮40 min，過濾藥液，然后加4 倍量水再次煎煮40 min 后過濾藥液，兩次煎煮濾液混合濃縮成生藥含量為1 g/mL 的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

依達拉奉注射液（吉林博大公司，批號：80-140603，規(guī)格：10 mL/15 mg）。

1.3 主要試劑及儀器

兔抗大鼠β-actin（批號：600008-1）；兔抗大鼠層粘連蛋白（LN）抗體（批號：A90082Ra01）；兔抗大鼠纖連蛋白（FN）抗體（批號：A90037Hu01）；兔抗大鼠B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體（批號：YD8891）；兔抗大鼠Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（批號：3351）；HRP標記山羊抗兔IgG（批號：E030120）；以上抗體均購于美國Proteintech公司。TUNEL試劑盒（上海魯汶生物，批號：S7100）；MCAO 栓線（北京西濃有限公司，批號：A4263450）。

AlphaEaseFC 灰度分析軟件（Adobe）；TGL-16c型離心機（上海安亭）；TYXH-Ⅱ渦旋混合器（天悅電子）；V300掃描儀（EPSON）。

2 方法

2.1 模型制備

應(yīng)用改良線栓法［7］制備大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠后，仰臥位固定，于頸正中切口，將左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈鈍性分離。夾閉頸總和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈并于其遠心端剪一切口，將栓線緩慢向頸內(nèi)動脈推入，到達大腦中動脈19～20 mm，回縮約2 mm 后固定栓線。缺血2 h后緩慢拔出栓線。假手術(shù)組只鈍性分離血管，不做其他處理。

2.2 分組及給藥

120 只大鼠隨機分成6 個組，分別為假手術(shù)組、模型組、依達拉奉組以及健脾補土方低、中、高劑量組。剔除喂養(yǎng)期間意外死亡及造模后死亡大鼠，每組剩余16 只，各組大鼠造模成功24 h 后給藥。依達拉奉等效劑量為3.2 mg/kg；健脾補土方給藥劑量按成人與大鼠等效劑量［8］換算，低劑量為3.69 g/kg，中劑量為7.38 g/kg，高劑量為14.76 g/kg；假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水。各組于每日同一時間給藥，每日1次，共給藥7 d。

2.3 動物取材

給藥7 d后，10%水合氯醛麻醉大鼠，予心臟灌注，迅速斷頭取腦，將缺血側(cè)腦組織于4%多聚甲醛中固定24 h 以上，石蠟包埋組織，作厚度為6 μm 的冠狀切片，用于TUNEL 檢測和免疫組織化學(xué)染色；分離缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)放入凍存管，置于液氮速凍，用于Western blot和RT-PCR檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 神經(jīng)功能缺損評分

采用Zea-Longa 5 級4 分法［7］對造模24 h 后的大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。術(shù)后評分在1～3 分者為造模成功，可納入為研究對象，0 分和4 分者剔除。分數(shù)越高，提示神經(jīng)功能損傷癥狀越嚴重。

2.4.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測FN、LN的表達

將切片進行烤片→脫蠟→滴加3% H2O2→0.01%檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)→滴加兔抗大鼠FN（1∶100）、兔抗大鼠LN（1∶100），4 ℃孵育過夜。次日滴加增強液孵育20 min→37 ℃孵育二抗，30 min→DAB 染色→蘇木素復(fù)染→鹽酸乙醇分化→脫水→透明→封片。采用光學(xué)顯微鏡拍照（× 400），以光密度值（integral optical density，IOD）進行表示。

2.4.3 TUNEL法檢測神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)（AI）參照TUNEL 試劑盒說明書，于光鏡下觀察切片，計數(shù)凋亡細胞。凋亡細胞的陽性細胞計數(shù)用AI 表示，隨機取每張切片的5 個高倍視野，結(jié)果取平均值。

AI（%）=陽性細胞數(shù)/全部細胞數(shù)×100%

2.4.4 Western blot檢測Bcl-2、Bax的表達取各組大鼠海馬組織置于冰上操作，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，充分研磨，靜置裂解20 min，4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清液進行BCA 定量。將處理后的蛋白樣品與Loading buffer按比例混勻，變性條件：95 ℃，10 min。取樣品總蛋白上樣量50 μg，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→兔抗大鼠Bcl-2（1∶2 000）、兔抗大鼠Bax（1∶6 000）4 ℃孵育過夜。二抗（1∶10 000，HRP 標記）室溫孵育1 h，ECL 顯影，用BIO-RAD Gel Doc?XR + 成像系統(tǒng)觀察拍照，Image J軟件分析條帶灰度值。

2.4.5 RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA取各組大鼠海馬組織，Trizol 法提取總RNA，酶標儀測定RNA 濃度，參照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，繼而行PCR 擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，10 min，循環(huán)條件：95 ℃，15 s→60 ℃，60 s（43 次循環(huán)），計算2-△△CT值。 引物序列為Caspase-3 上游：5' -GAAAGCCGAAACTCTTCATCAT-3' ，下游：5' -ATGCCATATCATCGTCAGTTCC-3'，長度93 bp；βactin 上游：5'-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3'，下游：5' -GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3' ，長度240 bp。均由谷歌生物公司合成。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)± 標準差（xˉ±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，符合方差齊性用LSD 法，不符合方差齊性采用Dunnet's T3 法檢驗，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評分比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Zea-Longa 評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，依達拉奉組和健脾補土方各劑量組Zea-Longa 評分均降低（P＜0.01，P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，分）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

神經(jīng)缺損評分0.00±0.00 2.32±0.32**1.67±0.28##1.84±0.47#1.69±0.28#1.50±0.46#組別假手術(shù)組模型組依達拉奉組健脾補土方低劑量組健脾補土方中劑量組健脾補土方高劑量組n 劑量16 16 16 16 16 16——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg

3.2 各組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞AI比較

與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)細胞AI 明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，依達拉奉組及健脾補土方各劑量組神經(jīng)細胞AI 明顯降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較（±s，%）

表2 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組依達拉奉組健脾補土方低劑量組健脾補土方中劑量組健脾補土方高劑量組神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)4.64±1.15 52.83±5.59**24.69±4.51#29.30±5.41#23.51±3.52#22.30±3.12#n888888劑量——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg

圖1 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較（TUNEL法，×400）

3.3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)FN、LN 表達比較

與假手術(shù)組相比，模型組FN、LN 表達明顯下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，依達拉奉組和健脾補土方各劑量組FN、LN 表達明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。見表3、圖2、圖3。

表3 各組大鼠FN、LN蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠FN、LN蛋白表達比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

劑量——組別假手術(shù)組模型組依達拉奉組8健脾補土方低劑量組健脾補土方中劑量組健脾補土方高劑量組LN（IOD值）38.93± 3.04 13.22±2.90**23.68±3.52##19.85±5.61##24.72±4.62##26.65±2.88##n88888 3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg FN（IOD值）35.56±1.48 9.59±2.03**21.17±4.88#19.57±4.22#22.40±3.19#23.32±5.45#

圖2 各組大鼠FN蛋白表達比較（免疫組化法，×400）

圖3 各組大鼠LN蛋白表達比較（免疫組化法，×400）

3.4 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)Bcl-2、Bax 蛋白表達比較

與假手術(shù)組相比，模型組Bal-2 蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01），模型組Bax 蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，依達拉奉組和健脾補土方各劑量組Bal-2 蛋白表達顯著增加（P＜0.05），Bax 蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值顯著升高（P＜0.01）。見圖4、表4。

圖4 各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達比較

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組依達拉奉組健脾補土方低劑量組健脾補土方中劑量組健脾補土方高劑量組Bcl-2/Bax 2.36±0.30 0.26±0.06**0.94±0.09##0.75±0.05##0.96±0.02##1.08±0.05##n888888劑量——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg Bcl-2/β-actin 0.73±0.13 0.19±0.10**0.48±0.09#0.44±0.11##0.49±0.10##0.53±0.07##Bax/β-actin 0.31±0.10 0.72±0.09**0.51±0.13#0.59±0.01#0.51±0.12##0.48±0.08##

3.5 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)Caspase-3 mRNA比較

與假手術(shù)組相比，模型組Caspase-3 mRNA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，依達拉奉組和健脾補土方各劑量組Caspase-3 mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

表5 各組大鼠Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組依達拉奉組健脾補土方低劑量組健脾補土方中劑量組健脾補土方高劑量組Caspase-3 mRNA（2-△△CT值）0.20±0.06 0.73±0.11**0.50±0.07#0.61±0.08#0.47±0.13#0.44±0.08#n888888劑量——3.20 mg/kg 3.69 g/kg 7.38 g/kg 14.76 g/kg

4 討論

缺血性卒中是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，易破壞血腦屏障，造成嚴重的腦損傷并引起神經(jīng)細胞凋亡［9］，CIRI是缺血性腦卒中后血流恢復(fù)灌注，腦內(nèi)代謝失償，進而導(dǎo)致缺血性腦卒中后神經(jīng)細胞加重損傷的主要原因之一。故深入研究腦缺血再灌注的病理機制，尋找促進神經(jīng)元保護和腦功能恢復(fù)作用的藥物對治療缺血性腦卒中具有重要意義。

腦缺血再灌注損傷后，ECM 降解，黏附分子損傷，神經(jīng)細胞脫離ECM，不能維持機體動態(tài)平衡從而發(fā)生神經(jīng)細胞失巢凋亡。FN 和LN 是組成ECM 中非膠原糖蛋白的重要部分，在各種神經(jīng)元中介導(dǎo)細胞黏附，介導(dǎo)軸突沿機制橋生長，使神經(jīng)纖維定向生長，并能保持血腦屏障的完整性［6，10］。Caspase-3 是目前公認的凋亡關(guān)鍵蛋白酶和細胞凋亡過程中的終末執(zhí)行酶，是細胞凋亡的最終共同途徑［11］。Bcl-2是在細胞凋亡的早期環(huán)節(jié)通過控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制細胞凋亡。Bax可增強線粒體通透性，釋放線粒體中的凋亡相關(guān)分子Apaf-1 激活Caspase，促進細胞凋亡［12］。LI 等［13］發(fā)現(xiàn)舒血寧注射液可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 比值，阻斷Caspase-3的激活，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，可有效改善缺血性中風(fēng)后的腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)ECM 相關(guān)分子與凋亡蛋白關(guān)系密切。韋德英等［14］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N 可提高Bcl-2/Bax 的比值，減少Caspase-3 的表達水平。葛風(fēng)等［15］研究發(fā)現(xiàn)，通過Caspase-3 基因可顯著促進LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡。

根據(jù)取類比象法，脾屬土，“土主承載”，神經(jīng)ECM為神經(jīng)細胞提供力學(xué)支持和物質(zhì)強度［5］，介導(dǎo)神經(jīng)細胞之間的黏附作用，保持神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的完整性，故本研究采用健脾補土方，以四君子湯為基礎(chǔ)，添加山藥、薏苡仁和黃芪［16］，顯著增加健脾補土益氣功效，這是本方通過調(diào)節(jié)神經(jīng)ECM抗腦缺血再灌注損神經(jīng)細胞凋亡作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可顯著上調(diào)腦缺血再灌注后p-ERK1/2 和p-Akt 的蛋白含量，增加Bax的表達，加強神經(jīng)細胞與ECM的黏附程度，抑制凋亡［17］；加味四君子湯可通過穩(wěn)定神經(jīng)ECM 纖維蛋白-5（Fibulin-5）的表達，顯著促進ECM與細胞之間的黏附作用，從而有效保護神經(jīng)細胞［18］；健脾補土方可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達，減少LN 降解［19-20］；下調(diào)組織型纖溶酶原激活物（t-PA）的可抑制纖溶系統(tǒng)活性，促進人Ⅳ型膠原（Col Ⅳ）、整合素相關(guān)激酶（ILK）、整合素β3和局部黏著斑激酶（FAK）的蛋白表達，減少ECM降解，從而改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)細胞損傷［16，21］。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦缺血再灌注后，大鼠神經(jīng)功能受損，神經(jīng)ECM降解，繼而發(fā)生失巢凋亡。健脾補土方的干預(yù)可顯著改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損，降低神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)，上調(diào)神經(jīng)ECM中FN、LN的表達，增強神經(jīng)細胞間的黏附作用，增加Bcl-2的表達，增強神經(jīng)細胞對損傷因子的抵抗性，從而降低促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達，抑制凋亡。

綜上，健脾補土方可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)ECM，減少FN、LN 的丟失，增加ECM 的黏附，抑制神經(jīng)細胞的凋亡，從而保護神經(jīng)細胞，減輕CIRI 模型大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，對抗腦缺血損傷。