基于網絡藥理學和分子對接技術探究半夏治療肺癌的作用機制

熊常州，韓坤余，陳彥蓓，劉衛，張哲，馬帥，牛華濤?

（1. 成都中醫藥大學，四川 成都 610075；2. 云南中醫藥大學，云南 昆明 650021；3. 云南省腫瘤醫院，云南 昆明 650118）

原發性支氣管肺癌（簡稱肺癌）是指起源于呼吸上皮細胞的惡性腫瘤，目前居全球癌癥發病率的第二位，是全球致死率最高的癌種。2020年全球肺癌新發病例共2 206 771 例（占癌癥發病總數的11.4%），死亡病例共1 796 144例（占癌癥死亡總數的18.0%）［1］。肺癌的病理分型主要為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，早期臨床癥狀以咳嗽、咳痰和咯血為主。治療措施主要包括根據患者腫瘤組織學特點、腫瘤分期及患者特異性情況采取外科手術、化學藥物治療、放射治療和分子靶向治療等。由于其早期臨床癥狀易被患者忽視，多數患者確診時已是晚期導致治療并不理想［2-3］。然而以上治療方案在治療過程中均存在一定局限性，如手術的某些禁忌癥、化療及放療的不良反應、分子靶向治療的耐藥性等［4］。

中醫學中并無肺癌之名，根據其臨床癥狀可歸屬于“咳嗽”“咯血”“肺積”“息賁”“癌病”等范疇。如宋代《濟生方·癥瘕積聚門》中提到：“息賁之狀，在右脅下，大如覆杯，喘息奔溢，是為肺積”，《圣濟總錄》中也指出：“肺積息賁氣脹滿咳嗽，涕唾膿血”，這些均與肺癌的臨床表現類似。在一些對肺癌患者體質的調查研究中發現，痰濕體質是肺癌患者主要的體質之一［5-6］。多位國醫大師也認為痰濕是肺癌發病的主要病機之一，肺癌的辨證應該多屬“痰、濕、瘀、虛、毒”［7-9］。由此可見，痰濕幾乎貫穿了肺癌發生、發展的全過程，因此在肺癌的臨床治療中要重視化痰散結藥物的應用。半夏作為臨床中常用的理氣化痰藥，其治療肺癌的作用機制也值得深入探究。

半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，味辛、性溫，有毒，歸肺、脾、胃經，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效［10］。現代藥理學研究顯示，半夏具有鎮咳、祛痰止嘔、抗腫瘤、抗胃潰瘍、凝血、抗菌和抗炎等藥理作用［11］。研究發現，半夏提取液可以誘導腫瘤細胞K562凋亡，延長K562細胞G0/G1期，干擾DNA的合成［12］，并且可以有效恢復腫瘤相關樹突細胞的未成熟狀態，增強其作為抗原呈遞細胞的功能，進一步引發抗腫瘤Th1 和CTL 反應［13-14］。此外，有研究發現半夏提取物可以顯著增加HPV +TC-1 細胞凋亡和壞死率，阻斷細胞周期的進行，進而抑制腫瘤生長和對缺血性壞死的抵抗力［15］，增強機體的免疫功能，并且可以直接對腫瘤細胞進行殺傷［16］，由此可知半夏提取物可能是一種潛在的癌癥免疫調節治療藥物。在中晚期肺癌的中藥治療用藥規律研究中發現，使用頻次最高的是化痰散結藥［17］，半夏的使用頻率均居前十位［18-23］，但其防治肺癌的作用機制尚不明了。

網絡藥理學是一種從網絡觀點出發，以系統水平識別“藥物-疾病-基因-靶點”的多分子藥物協同作用機制的新型研究策略，其核心思想與中醫學的整體觀念有一定相通之處，符合對腫瘤等復雜疾病進行系統性治療的需求［24］。基于此，本研究通過網絡藥理學，挖掘半夏治療肺癌的作用靶點，結合生物信息學的優勢，探究半夏防治肺癌的有效活性成分、潛在治療靶點和作用機制，為半夏治療肺癌提供臨床及藥理作用研究基礎。

1 材料與方法

1.1 半夏活性成分及作用靶點的篩選與收集

在TCMSP 數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索半夏，設定生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 得到半夏活性成分，選擇“Re-lated Targets”獲取半夏活性成分所有靶點，并通過Uniprot（http：//www.Uniprot.org）數據庫獲取半夏活性成分對應的人類靶標基因。

1.2 肺癌相關靶點的獲取

以“lung cancer”為關鍵詞在DisGeNET（www.disgenet.org）數據庫檢索肺癌相關基因，檢索物種為“Homo sapiens”。

1.3 半夏抗肺癌的潛在作用靶點的獲取

通過韋恩圖（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將半夏的活性成分潛在靶點和肺癌的相關靶點映射交集，得到交集基因并繪制韋恩圖。

1.4 靶標蛋白互作網絡（PPI）的構建

將上述半夏抗肺癌的潛在作用靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org）。將下載的文件導入Cytoscape 3.8.0 軟件進行可視化分析，構建半夏治療肺癌的靶標蛋白互作（PPI）網絡，進一步使用CytoHubba 插件進行網絡拓撲分析，參考MCC 值篩選網絡中關鍵靶點。

1.5 GO功能和KEGG信號通路富集分析

分別在Metascape（http：//metascape.org/）平臺和HIPLOT 數據庫（https：//hiplot.com.cn）平臺對核心靶點進行分析，將物種設置為人，進行GO 功能和KEGG信號通路富集分析，設置P＜0.05 為差異有統計學意義，輸出結果并繪制氣泡圖或條形圖。

1.6 半夏抗肺癌主要靶點的分子對接

通過PubChem 下載“1.4”項下篩選的半夏抗肺癌的主要活性成分的“SDF”格式，并將其導入“Chem3D 19.0”優化三維結構；從PDB 數據庫下載“1.4”項下篩選出的半夏抗肺癌的主要核心靶點蛋白的蛋白質3D結構，并保存pdb 格式。利用AutoDock Tools 對成分和蛋白進行加水、去氫、分離配體和受體等操作，利用AutoDock Vina 計算靶點與配體之間對接活性的分值，得分＜-5.0則結合活性較佳，得分＜-7.0說明兩者之間有強烈的對接活性，可作為半夏治療肺癌作用靶點的篩選依據［25］。

2 結果

2.1 半夏的活性成分及作用靶點

通過TCMSP數據庫，檢索到半夏化學成分116種，使用OB ≥30%和DL ≥0.18 條件獲得包括24-乙基膽堿-4-烯-3-酮、卡維汀、黃芩素、中黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇、二十碳-11-烯酸和松柏苷等在內的13種活性化合物。見表1。將對應蛋白導入Uniprot數據庫，通過篩選共得到97個靶點基因。

表1 篩選后半夏活性成分情況

2.2 肺癌相關靶點的獲取

以“lung cancer”為關鍵詞，檢索物種為“Homo sapiens”，在DisGeNET數據庫進行檢索，搜集到肺癌靶點共4 174個。

2.3 半夏抗肺癌的潛在作用靶點的獲取

通過韋恩圖（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）制作，將半夏97個成分潛在靶點和肺癌4 174個相關靶點映射交集，得到39 個交叉靶點，即半夏治療肺癌潛在作用靶點。見圖1。

圖1 肺癌相關基因與半夏活性成分對應靶點韋恩圖

2.4 靶標蛋白互作網絡（PPI）的構建

將39個潛在作用靶點上傳至STRING 數據庫進行分析，得到靶標蛋白互作數據關系，利用Cytoscape 3.8.0 軟件進行可視化分析，構建半夏治療肺癌的靶標蛋白相互作用網絡。見圖2。在拓撲網絡中包含39 個節點，240 條邊，平均節點度為12.3，平均局部聚類系數為0.725。進一步利用CytoHubba 插件對網絡進行拓撲分析，根據MCC 值篩選網絡中的關鍵靶點，根據MCC 值取前10 個關鍵靶點，從大到小排列，分別是抑癌基因p53（Tumor Protein P53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RAC-α（Serine/threonine proteinase RAC- α，AKT1）、缺氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、轉錄因子AP-1（Transcription Factor AP-1，JUN）、血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Cysteine-containing aspartate-specific proteases3，CASP3）、細胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9（Cysteine-containing aspartate-specific proteases9，CASP9）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8（Cysteine-containing aspartatespecific proteases8，CASP8）和細胞周期蛋白B1（Cyclin B1，CCNB1）。這些靶點可能是半夏治療肺癌的重要靶點。見表2和圖3。

表2 關鍵靶點TOP 10（根據MCC分值）

圖2 半夏抗肺癌靶標蛋白相互作用網絡

圖3 關鍵靶點TOP 10

2.5 GO功能和KEGG信號通路富集分析

將39 個核心靶點導入HIPLOT 數據庫（https：//hiplot.com.cn）進行GO 功能富集分析，按照P＜0.05進行篩選，分析P值排名前10 名結果，涉及的生物過程（biological process，BP）主要包括對金屬離子的反應、氧化應激反應、活性氧（reactive oxygen species，ROS）反應、細胞對化學應激的反應、對有毒物質的反應、缺氧反應、對氧水平降低的反應、對氧水平的反應、肽基絲氨酸磷酸化和細胞對氧化應激的反應。見圖4。分子功能（molecular function，MF）主要涉及泛素樣蛋白連接酶結合、蛋白激酶調節活性、激酶調節活性、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路、半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡過程、組蛋白激酶活性、蛋白磷酸酶2A（PP2A）結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶激活劑活性、細胞周期素依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調節活性和過氧化物酶活性。見圖5。細胞組分（cellular component，CC）主要涉及膜筏、膜微區、膜區、轉移酶復合物，轉移含磷基團、分泌顆粒腔、細胞周期素依賴性蛋白激酶全酶復合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、蛋白激酶復合物、髓鞘和血小板α 顆粒腔。見圖6。

圖4 半夏抗肺癌潛在靶點的GO-BP富集分析

圖5 半夏抗肺癌潛在靶點的GO-MF富集分析

圖6 半夏抗肺癌潛在靶點的GO-CC富集分析

將39 個核心靶點導入至Metascape 平臺進行KEGG 通路富集分析，按照P＜0.05 進行篩選，取Metascape 平臺分析P值排名前12名的結果，分別為癌癥通路、乙型肝炎、愛潑斯坦-巴爾病毒感染（EB 病毒感染）、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、腫瘤蛋白多糖、內分泌抵抗、PI3K/Akt 信號通路（PI3K/Akt signaling pathway）、癌癥的MicroRNAs（miRNAs）、脂肪細胞脂解作用的調控、NOD 樣信號通路、腫瘤轉錄因子的轉錄調控和化學致癌作用。見圖7。

圖7 半夏抗肺癌潛在靶點的KEGG通路富集

2.6 半夏抗肺癌主要靶點的分子對接

選取核心成分中排名靠前的黃芩素與核心蛋白TP53、AKT1、HIF-1α、VEGFA 進行分子對接，得分均＜-5.0，說明兩者之間有良好的對接活性，可作為半夏治療肺癌作用靶點的篩選依據。見圖8、表3。

表3 黃芩素與核心靶點分子對接得分

圖8 半夏抗肺癌核心成分與靶點分子對接圖

3 結論

通過TCMSP 數據庫檢索可知，半夏的主要活性成分主要有黃芩素、β-谷甾醇和豆甾醇等。黃芩素可以通過逆轉Src 的高磷酸化，抑制Id1 蛋白表達，消除上皮間質轉化和血管生成，從而抑制非小細胞肺癌生長及增殖［26-27］。研究發現，黃芩素可以抑制人非小細胞肺癌H460 細胞系中12-LOX 基因和蛋白的表達，誘導人非小細胞肺癌H460 細胞凋亡［28］。黃芩素還可以通過下調miR-424-3p 和靶向PTEN/PI3K/Akt 通路來誘導細胞周期停滯、凋亡并增加對A549 和H460細胞的順鉑敏感性，且有良好的安全性［29-30］。β-谷甾醇可以通過阻滯肺癌A549細胞周期于G2/M 期來抑制細胞增殖，同時促進細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用［31］。有體外實驗發現，豆甾醇可以抑制卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、膽囊癌、胃癌和皮膚癌等多種腫瘤細胞，其機制涉及降低PI3K/Akt 信號通路的蛋白質和mRNA 表達、上調凋亡基因的表達、誘導細胞周期阻滯以及破壞腫瘤血管的生成等［32-33］，但是尚無涉及肺癌的相關實驗。由此可知，半夏的這些活性成分與腫瘤的發生、發展緊密相關，在肺癌的治療中發揮著復雜的作用，為半夏抗癌的研究提供了可靠依據。

通過分析靶標蛋白互作網絡，TP53、AKTI、HIF-1α 和VEGFA 處于網絡的核心地位，可視為半夏治療肺癌的關鍵靶點。TP53是編碼腫瘤蛋白p53的抑癌基因，位于17號染色體短臂（17p13），外顯子5-8是人類腫瘤突變的熱點區［34］。TP53 基因突變可以引起抑癌功能喪失、干擾p53相關蛋白、耐藥基因上調、Axl酪氨酸激酶受體過度表達等，導致間質和上皮性腫瘤出現早期發病的傾向［35］。有研究發現TP53 基因突變幾乎發生在所有的小細胞肺癌中，該基因在非小細胞肺癌中也是常見的突變基因，可以作為非小細胞肺癌療效和預后的生物標志物［36-38］。蛋白激酶B（AKT）在人類癌癥中最常因上游調節因子的突變而激活［39］，其中AKT1 突變是硬化性肺細胞瘤的遺傳標志［40］。AKT1蛋白的表達參與了肺癌的發展及轉移［41］。HIF-1 可調控約200 種靶基因的表達水平，其機制有調節腫瘤細胞的缺氧適應、血管形成、細胞活性、細胞代謝和增殖轉移等［42］。HIF-1α 受硫化氫調控，能夠調節非小細胞肺癌上皮-間充質轉化和血管生成［43］，在肺癌的發生、轉移、評估和預后中起重要作用［44］。VEGFA 是肺癌血管生成的關鍵因素，可通過介導內皮細胞增殖，增加血管通透性，促進腫瘤細胞的生長和轉移［45-46］，與肺癌組織的臨床分期、組織分化和淋巴轉移密切相關［47-48］。

通過GO 功能富集分析，發現半夏治療肺癌的潛在靶點參與了多項生物過程，其中ROS 反應、PP2A 結合、氧化應激反應涉及靶點較多，度值較高。ROS是一類在細胞正常代謝過程中產生的具有強氧化性的小分子化學物質［49］，適量的ROS 能夠促進腫瘤細胞增殖和分化，過多則又會導致細胞內氧化應激增強，而造成脂質、蛋白質和DNA 的氧化損傷，最終導致腫瘤細胞的凋亡或壞死［50-51］。ROS 代謝功能的增高程度不同，對于腫瘤發生、發展的結局也截然不同，所以合理調控ROS，使其在腫瘤治療中發揮積極作用就變得十分重要。PP2A 主要是指絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，它是一種重要的腫瘤抑制蛋白，可以通過A、B、C 三種亞基的突變、缺失、失活和異常表達調節許多致癌信號通路［52-53］。氧化應激是ROS的產生與抗氧化劑的效率之間平衡紊亂的狀態［54］，可導致基因表達、細胞增殖和細胞凋亡的變化，并在腫瘤的發生和發展中起重要作用［55-57］。這些均表明半夏可能是通過調節細胞對能量代謝、信號通路、蛋白活性和基因表達等多個生物過程與分子功能，從而發揮治療肺癌的作用。

在KEGG 信號通路富集分析中發現，半夏在治療肺癌的過程中主要涉及癌癥通路、腫瘤蛋白多糖、PI3K/Akt 信號通路、癌癥的miRNAs、癌癥中的轉錄失調及化學致癌等多個信號通路，這些通路都與肺癌的發生和發展密切相關。研究發現通過下調PI3K/Akt信號通路的蛋白表達可以抑制非小細胞肺癌A549 細胞生長，并促進其凋亡，進而降低腫瘤標志物水平［58-60］。PI3K/Akt 信號通路還發揮著免疫調節劑的關鍵作用，通過聯合使用免疫調節劑抑制PI3K/Akt 信號通路可以為腫瘤的治療提供新的途徑［61］。miRNAs 參與了腫瘤細胞生長、分化、增殖、凋亡及侵襲等重要生物學行為。有研究發現，以血源性miRNA 為特征進行液體活檢檢測肺癌具有較高的準確性、敏感性和特異性，提示血源性miRNA 作為潛在循環標志物或許可以作為影像學、痰細胞學和活檢的補充，用于肺癌的檢測［62］。另有研究發現，不同亞型miRNAs 在肺癌化療抵抗中發揮不同的作用，如miR-21 可以下調PTEN表達促進非小細胞肺癌細胞耐藥，miR-539 過度表達可通過阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡等作用增強耐藥非小細胞肺癌細胞對順鉑的敏感性［63］。腫瘤患者化療耐藥時間的長短與患者的生存時間密切相關，而不同miRNAs會對肺癌的治療有不同的作用，如何通過調控miRNAs 發揮其在肺癌化療中減毒增效的作用及具體的作用機制值得進一步探究。以上富集分析顯示，半夏活性成分的潛在靶點分布于多個生物過程及信號通路，這些有效成分協同發揮著防治肺癌的作用。

本研究通過挖掘開放數據庫中豐富的實驗和臨床資料，利用網絡藥理學及分子對接技術探究半夏治療肺癌的作用機制，發現其可以通過多活性成分、多靶點和多信號通路對肺癌的進行干預，這為今后半夏治療肺癌的藥理研究及臨床應用提供了理論依據及新思路。但網絡藥理學的預測分析仍存在一定不足，如數據庫的準確性和全面性不完善、數據更新相對滯后、未涉及到半夏的種類、臨床用藥劑量、藥物之間相互作用等對肺癌治療的影響，未來可以利用細胞分子生物學和免疫學等實驗手段進一步驗證，以便深入研究半夏防治肺癌的作用機制。