核桃品種及近緣樹種鑒定的DNA條形碼開發

張煥玲

(西北農林科技大學 林學院,陜西 楊凌 712100)

0 引言

核桃(Juglansregia)屬胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(Juglans)落葉喬木樹種,是我國主要的木本油料和干果樹種,居世界4大堅果之首。20世紀50年代我國開始核桃引種和選育工作,目前核桃栽培面積和年產量均居世界首位,栽培的核桃品種已達500多個[1]。但核桃栽培中品種管理混亂,以次充好、種苗混雜現象嚴重,不但影響核桃栽培的經濟效益,而且損害了良種持有人和種植戶的利益[1]。因此,快速、準確地開展核桃品種鑒定,對促進核桃產業健康發展具有重要意義。目前,核桃品種鑒定主要依據形態特征,結合物候特點及同工酶等指標來進行[2-4]。由于核桃品種間本身形態差異小,且種苗交易多在非果期,僅通過枝、葉和樹皮等表型特征很難準確鑒別品種,急需新的快速鑒定技術。

DNA條形碼技術(DNA barcoding)是指可以利用生物體基因組中的一個或者幾個能夠代表該物種的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段,快速實現物種鑒別的一種方法[4-6]。該技術具有操作簡單、準確性高和穩定性好等特點,目前已廣泛應用于動植物和微生物的鑒定中,并有力地推動了物種分類和系統發育學科的快速發展[6-14]。

高等植物DNA條形碼研究主要集中在葉綠體基因組和核基因組,葉綠體基因DNA片段如matK、rbcL、psbA-trnH以及核糖體DNA片段ITS是目前廣泛應用的DNA條形碼[15-19]。在胡桃科的相關研究中,陳亞輝等[20]應用DNA條形碼對不同品種美國山核桃進行研究,發現ITS和matK序列可以有效鑒別不同品種。宋艷波等[21]基于matK基因序列對核桃的早、晚食品種進行鑒別。朱鳳琴等[9]發現利用ITS序列可區分核桃、核桃楸、山核桃以及楓楊屬的相關物種。本研究利用國際生物條形碼聯盟(CBOL)推薦的4條首選DNA條形碼序列,對生產中廣泛栽培的11個核桃品種和5個近緣樹種開展分子鑒定,以期篩選穩定性好、適應性高的DNA條形碼,為核桃品種的快速鑒定和核桃產業的健康發展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料包括14份核桃屬樹種(11個核桃品種和3個核桃種)、1個楓楊屬樹種和1個山核桃屬樹種,見表1。均來自西北農林科技大學渭河試驗站核桃種質資源圃。

表1 實驗材料編號及信息Tab.1 Material number and information

每樹種(品種)分別采集5個樣株,樣株為當年生新鮮健康葉片100 g(作為5次生物學重復),置于裝有硅膠顆粒的自封袋內,帶回實驗室于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 總DNA的提取

用改良的十六烷基三甲基溴化銨法(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)提取總DNA:在2 mL離心管中加入CTAB提取緩沖液1 mL,65 ℃水浴預熱;取葉片0.2 g,加入液氮快速研磨;在預熱的CTAB提取緩沖液中加入20 μLβ-巰基乙醇,倒入葉片研磨粉充分混勻,后置于65 ℃水浴中保溫45 min,其間輕輕晃動離心管數次;離心管中加入等體積氯仿和異戊醇(其比例為24∶1),輕輕顛倒混勻,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,移上清至另一個新的2 mL離心管中(此步驟重復2次);離心管中加入2倍體積的無水乙醇于-20 ℃放置30 min后,12 000 r/min離心10 min回收DNA沉淀;棄上清,用70%乙醇清洗沉淀2次,室溫干燥DNA沉淀;將DNA溶于100 μL的TE緩沖液中溶解,加入RNA水解酶10 μL去除RNA,4 ℃保存備用。

1.3 目的片段的擴增、回收與測序

本研究選用國際生物條形碼聯盟(CBOL)推薦的3個葉綠體基因組候選條形碼rbcL、matK和trnHpsbA片段,以及1個核基因組候選條形碼ITS1。4個候選條形碼的通用引物從美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)查詢,由上海生工合成,引物信息及相應PCR反應條件詳見表2。

表2 4個候選條形碼的引物序列及擴增條件Tab.2 Primer sequences and amplification conditions of four candidate barcodes

PCR反應總體積60 μL:其中1對引物各3 μL,Taq Master Mix 30 μL,模板DNA 6 μL,超純水18 μL。 擴增產物經0.1 %的瓊脂糖凝膠100 V電壓下電泳分離,凝膠成像系統觀察記錄電泳結果。將凝膠上的目的條帶切下后用Monarch DNA回收試劑盒回收目的片段,送西安擎科澤西生物科技責任有限公司進行雙向測序,測序引物同PCR引物。

1.4 序列校對與分析

測序后的序列經DNAman10.0軟件拼接、校對。然后用MEGA-X軟件對測序文件進行手動調整,最后測序結果以FASTA格式輸出。用MEGA-X分析序列堿基組成、GC 含量、變異位點、簡約信息位點。

1.5 遺傳距離估算與系統發育分析

以變異位點最豐富的條形碼序列為數據,將處理與分組后的數據導入MEGA-X軟件,進行Clustal W對比,采用Kimura2-parameter(K2-P)模型計算遺傳距離,以最大簡約法(Maximum Parsimony,MP)構建系統發育樹,用1 000次重復bootstrap檢驗各分支的支持率,自展支持率需大于等于50%。

2 結果與分析

2.1 4種候選條形碼的PCR擴增與測序結果

4種候選條形碼在16個 樹種(品種)中均獲得了預期的擴增條帶,擴增成功率為100%,如圖1所示。

測序結果表明,rbcL序列在樣品間差異極小,僅楓楊與其他樹種存在一個堿基的差異(597位楓楊為A,其他樹種為G),11個核桃品種之間的rbcL序列完全一致,故在后續實驗分析中排除rbcL序列。psbA-trnH序列只在屬間存在差異,在屬內序列一致性為100%,不符合作為DNA條形碼進行品種鑒定的要求,故排除。

圖1 4條候選條形碼的部分擴增結果Fig.1 Partial amplification results of four candidate barcodes

ITS1和matK序列在樹種(品種)內序列一致性為100%,在樹種(品種)間序列有差異。不同樹種的ITS1和matK序列長度以及堿基G、C含量見表3,大小分別為696～701 bp和612～619 bp。2條序列的堿基G、C含量差異較大,ITS1序列堿基G、C含量為56.02%～58.71%,而matK序列堿基G、C含量為34.05%～34.74%,ITS1序列的G、C含量明顯高于matK序列,說明matK序列發生變異的可能性要比ITS1序列大,ITS1序列則相對穩定。

表3 不同樹種(品種)ITS1和matK條形碼序列的長度及GC堿基含量Tab.3 Sequence length and GC content ofITS1 and matK in different species(cultivars)

續表3

2.2 ITS1和matK序列變異分析

應用MEGA-X對各序列進行對比,發現16個樹種(品種)間在matK序列中共發生18個堿基位點變異,見表4,其中單核苷酸變異位點3個,簡約性信息位點數15個,有2處發生堿基缺失,序列一致性為99.12%。matK序列在屬間的差異明顯大于種間或品種間,楓楊和碧根果中的變異位點要明顯多于其他核桃品種或核桃屬樹種。在11個核桃品種中,除‘維納’和‘六盤水’品種matK序列一致外,其他9個核桃品種matK序列均存在差異。

16個樹種(品種)的ITS1序列變異位點相比matK序列要少很多,只有8個堿基位點變異,見表5,其中單核苷酸變異位點2個,簡約性信息位點數6個,序列一致性為99.88%。除了‘維納’與‘清香’和野核桃的ITS1序列完全一致外,其他9個核桃品種及4個近緣樹種間的ITS序列均存在差異,matK不能區分的‘維納’和‘六盤水’品種可以被ITS1區分。

綜上,matK結合ITS1序列可以鑒定所有供試的核桃品種及近緣種,是核桃品種及近緣種鑒定的理想DNA條形碼。

表4 不同樹種(品種)的 matK序列變異位點Tab.4 The variable sites of matK sequence of different species(cultivars) bp

續表4

表5 不同樹種(品種)的ITS1序列變異位點Tab.5 The variable sites of ITS1 sequence of different species (cultivars)bp

2.3 遺傳距離及系統發育分析

為了驗證篩選條形碼的鑒定準確性,本文基于matK序列,以Kimura-2參數模型計算了不同樹種(品種)間的遺傳距離見表6,并以最大簡約法(Maximum Parsimony,MP)構建了16個樹種(品種)的系統發育樹,如圖2所示。

圖2 基于matK序列構建的MP系統發育樹Fig.2 Maximum parsimony tree based on matK barcode

結果表明,核桃品種間的遺傳距離要明顯小于屬間和種間的遺傳距離。11個核桃品種的遺傳距離為0.000 0～0.009 7,‘六盤水’與‘清香’、‘清香’與‘維納’的遺傳距離最大,均為0.009 7,而‘六盤水’與‘維納’的遺傳距離為0。8個國內核桃品種中,‘中林’與‘香玲’的遺傳距離最大,為0.008 3,‘陜核5號’和‘溫184’遺傳距離最小,為0.001 1。與近緣種相比,核桃品種與碧根果的遺傳距離最大,與‘獅子頭’之間的距離次之,與野核桃和楓楊之間的遺傳距離相對最小。

表6 不同樹種(品種)matK序列之間的遺傳距離Tab.6 Genetic distances of matK sequences among different species (cultivars)

MP系統發育樹顯示,除‘維納’和‘六盤水’外,其他不同核桃品種都能明顯區分,表明matK條形碼可準確鑒定82%的核桃品種,而且基于matK條形碼構建的系統發育樹能準確區分胡桃科楓楊屬、核桃屬和山核桃屬的遺傳進化關系,可為胡桃科植物區分或育種研究提供依據。

3 結論與討論

本研究以國際生物條形碼聯盟(CBOL)推薦的4個DNA序列為候選條形碼,通過擴增、測序和序列分析,篩選確定了matK+ITS1條形碼組合可有效鑒別11個核桃品種及核桃屬與楓楊屬、山核桃屬樹種,彌補了胡桃科樹種傳統形態學分類的不足,對研究核桃屬植物的系統分類、群體演化和資源開發,確保核桃產業良種化健康發展具有重要作用。

DNA條形碼技術因其操縱簡單、結果穩定,在物種和品種鑒定中被廣泛采用。盡管CBOL推薦了不少首選DNA條形碼,但同一條形碼在不同樹種中的擴增成功率、不同條形碼的引物通用性、條形碼的變異性大小均存在差異[19],實際應用中必須開發適合目的樹種的最佳條形碼。

rbcL是葉綠體基因組中編碼核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶大亞基的基因,由于有容易擴增、通用性好、易于比對序列等特征,故被提議為候選的DNA條形碼序列[7],但該基因變異性很小,很難區別種級水平的物種[18],本研究也證實了這一點,除了楓楊有一個位點變異外,其他15個樹種rbcL序列完全一致。psbA-trnH是葉綠體基因組中進化速率最快的基因間隔區之一,其psbA端的序列為編碼基因,有較高的保守性,便于設計廣泛應用的引物,且容易擴增[8]。但由于該片段中有較多的polyA/T結構,并且插入/缺失現象很常見,引起不同物種間的序列長度相差較大,造成使用psbA-trnH片段進行對非同屬類群間比較時有困難[19],本文結果也表明psbA-trnH序列只在屬間有差異,在屬內完全一致。

matK基因是葉綠體基因組編碼蛋白質基因中進化較快的基因之一,其擴增效率一直是作為通用條形碼序列的爭議問題[16],但該基因在美國山核桃品種鑒定中擴增效率和引物通用性都較好[19],也是本研究中鑒定核桃品種及其近緣樹種效果最理想的條形碼。ITS1序列是位于18S與5.8S rRNA編碼基因之間的片段,具有拷貝數高、易擴增的特點,是美國山核桃品種鑒定中變異位點最多的條形碼[19]。本研究中,核桃品種及其近緣種的ITS1序列變異沒有matK序列豐富,但其可以作為補充條形碼鑒別matK序列不能鑒別的核桃品種。

核桃是我國栽培面積最廣的經濟林干果之一,核桃品種之間的形態特征差異小,分子手段鑒定品種十分必要。本文只從4個候選條形碼序列中開展了11個核桃品種和5個近緣種的DNA條形碼篩選研究,擴大候選條形碼和樹種(品種)范圍,篩選更多的DNA條形碼并驗證篩選的2種條形碼的通用性是下一步研究的重點。