AFB1污染花生油激光誘導(dǎo)熒光信號(hào)受溫度干擾規(guī)律及溫度全局模型研究

何學(xué)明, 陳 敏, 楊小云, 張曼曼, 沈 飛, 袁 建, 胡秋輝, Firew Tafesse Mamo

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)

花生油在日常生活與食品生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，2020年，我國(guó)花生油總生產(chǎn)量達(dá)到320萬(wàn)t，位居世界第一。然而作為一種季節(jié)性較強(qiáng)的農(nóng)作物，花生在收獲前，當(dāng)受到干旱和蟲害的威脅時(shí)，易被黃曲霉感染，收獲后，盛夏季節(jié)高溫多雨，空氣中水分含量較大，受溫濕度和儲(chǔ)藏方式等諸多因素影響，也極容易發(fā)生霉變[1]。對(duì)于已經(jīng)發(fā)霉、破損的花生原料在儲(chǔ)藏期間都會(huì)增加霉變的概率，在儲(chǔ)藏過程中產(chǎn)生的真菌毒素會(huì)迅速擴(kuò)散污染更多的作物[2]。花生油中的真菌毒素超標(biāo)原因主要有：原料污染帶入、加工過程污染、儲(chǔ)存運(yùn)輸不當(dāng)、精煉工藝不當(dāng)?shù)萚3]。花生油中污染的主要是黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1) 及黃曲霉毒素G2(AFG2)4種。黃曲霉毒素難溶于水、乙烷和乙醚，但易溶于甲醇、氯仿和乙腈等有機(jī)溶劑中，熔點(diǎn)為200～300 ℃，熱穩(wěn)定好，耐高溫[4, 5]；黃曲霉毒素在弱酸環(huán)境中相對(duì)比較穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中會(huì)發(fā)生降解，喪失熒光性[6]。研究表明AFB1是所有黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)，且是花生油中含量最多的一種，約為黃曲霉毒素總量的65%～80%[7]。AFB1是目前發(fā)現(xiàn)的致癌力最強(qiáng)的天然物質(zhì)(約為氰化物的10倍，砒霜的68倍)，1993年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將AFB1定為I類致癌物質(zhì)[8, 9]。它主要是對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織具有強(qiáng)烈致癌、致畸和致突變等破壞作用。黃曲霉毒素危害人體健康主要是通過食用被黃曲霉毒素污染的食物，即使是痕量級(jí)水平的毒素長(zhǎng)時(shí)間攝入可造成慢性中毒引起纖維病變[10]。我國(guó)2017年頒布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017) 規(guī)定花生油中AFB1限量指標(biāo)為20 μg/kg[11]，美國(guó)食品與藥物管理局同樣規(guī)定花生油中黃曲霉毒素總量不得高于20 μg/kg[12]。

目前用于AFB1的檢測(cè)方法主要有：生物鑒定法、化學(xué)分析法、免疫分析法與儀器分析法。其中生物鑒定法需要飼養(yǎng)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不可控因素多，靈敏性和專一性較低。化學(xué)分析法常用的是薄層色譜法(TLC)，該方法的原理是：在紫外波長(zhǎng)365 nm的照射下，AFB1將產(chǎn)生藍(lán)紫色的熒光，根據(jù)薄層板上所顯示熒光的最低檢測(cè)量來確定黃曲霉素的含量。雖然該方法成熟較早但檢測(cè)精度低，在實(shí)驗(yàn)過程中的揮發(fā)物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員與環(huán)境造成危害，樣本前處理繁瑣，因此難以在實(shí)際中應(yīng)用。免疫分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、免疫親和柱法(IAC)和免疫膠體金技術(shù)(ICS)等。其中ELISA法在植物油中有相關(guān)研究[13]，該方法具有靈敏、操作簡(jiǎn)單、處理量大、不需要專用的大型設(shè)備、對(duì)操作人員要求也不高、成本也相對(duì)較低的優(yōu)點(diǎn)，但是由于酶生產(chǎn)技術(shù)有限，且對(duì)保藏要求高，因此酶的不確定性使該方法經(jīng)常出現(xiàn)假陽(yáng)、陰性結(jié)果，除此之外，樣品提取程度和樣品基質(zhì)對(duì)抗原抗體反應(yīng)的影響也會(huì)導(dǎo)致在實(shí)際樣品的定量分析過程中常會(huì)發(fā)生測(cè)定值偏差的現(xiàn)象。目前被普遍采用的儀器分析法有高效液相色譜、氣相色譜法(GC)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)，這些傳統(tǒng)儀器分析技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高精度AFB1的檢測(cè)，但儀器昂貴，樣本需要前處理，操作復(fù)雜，檢測(cè)速度較慢，檢測(cè)成本高。

近些年來，為了能夠檢測(cè)到農(nóng)產(chǎn)品中微弱的黃曲霉毒素信號(hào)，將傳統(tǒng)熒光法中的光源替換成了激光，并引入化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析光譜數(shù)據(jù)中隱藏信息，該方法即為激光誘導(dǎo)熒光光譜法(LIF)。LIF技術(shù)檢測(cè)AFB1的原理是根據(jù)AFB1在紫外光激發(fā)下(340～400 nm)會(huì)發(fā)出藍(lán)色(450 nm)熒光，該方法使用激光作為激發(fā)光源，提高了檢測(cè)靈敏度，且該技術(shù)在對(duì)污染樣本判別時(shí)所依據(jù)的是AFB1的特征熒光峰，是一種直接測(cè)量方法。現(xiàn)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道將LIF技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)受AFB1污染的花生[14]、 榛子[15]、開心果[16]等。結(jié)果顯示，檢測(cè)花生中AFB1時(shí)，其相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.99，區(qū)分AFB1污染和未污染榛子的正確率為92.3%，開心果中AFB1的檢測(cè)結(jié)果與HPLC檢測(cè)一致。Rasch等[17]利用LIF技術(shù)在葡萄酒生產(chǎn)過程中定性和定量測(cè)定真菌毒素污染情況，結(jié)果表明對(duì)于受AFB1污染的不同品種酒，其熒光光譜形狀是存在一定差異的。

激光誘導(dǎo)熒光光譜技術(shù)易受溫度等環(huán)境因素的影響。其中溫度的影響對(duì)熒光光譜檢測(cè)產(chǎn)生影響的因素非常多，當(dāng)被檢測(cè)樣品確定時(shí)，環(huán)境溫度對(duì)檢測(cè)的影響較大。通常，溶液中分子運(yùn)動(dòng)加劇，就會(huì)有更多的熒光分子與溶劑發(fā)生碰撞，發(fā)生熒光猝滅，從而降低熒光強(qiáng)度[18]。目前研究證明大多數(shù)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度是隨溫度的升高而降低。梁穎等[19]研究了溫度對(duì)三角褐指藻葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懀Y(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)熒光參數(shù)有顯著影響且溫度高的實(shí)驗(yàn)組具有較低的熒光強(qiáng)度。易黎麗等[20]研究發(fā)現(xiàn)煉油廠中石油類污染物的熒光峰光譜的輪廓形狀和熒光峰的位置不隨檢測(cè)溫度的變化而改變，但熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高而降低，從而提出對(duì)含油污水中油的種類及含量檢測(cè)時(shí)的溫度校正補(bǔ)償。因此，在進(jìn)行常規(guī)熒光技術(shù)檢測(cè)時(shí)，若把這種溫度變化對(duì)建立的模型影響降低，常用的方法是建立數(shù)學(xué)模型時(shí)，將溫度變化因素考慮進(jìn)去。即通過建立模型時(shí)加入實(shí)際應(yīng)用中所涉及到的溫度范圍數(shù)據(jù)，降低溫度波動(dòng)對(duì)預(yù)測(cè)模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)共購(gòu)買10個(gè)品牌花生油，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定樣品中AFB1的含量(GB/T 5009.22—2016)，經(jīng)測(cè)量均未檢出AFB1。各品牌花生油生產(chǎn)地點(diǎn)、生產(chǎn)方式與等級(jí)匯總在表1中。

表1 10個(gè)品牌花生油生產(chǎn)地點(diǎn)、生產(chǎn)方式與等級(jí)

稱取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)1 mg于100 mL容量瓶中用乙腈(色譜純)溶解并定容配制成黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液母液 (10 000 μg/kg)，母液存于-18 ℃冰箱中備用。加入18、36、72、90、108 μL的10 000 μg/kg的AFB1溶液，配制污染AFB1為5、10、20、25、30 μg/kg的花生油，作為污染樣本組。加入108 μL的乙腈到花生油中，配置AFB1濃度為0的植物油樣本，純花生油作為控制組。每個(gè)污染濃度與對(duì)照組各10個(gè)樣本，每種花生油在每個(gè)溫度的樣本數(shù)為70。

使用恒溫水浴鍋(HH-6)與冰箱將花生油溫度分別控制在10、20、30、40、50 ℃，通過溫度計(jì)(TA601)測(cè)量溫度。每個(gè)品牌植物油共準(zhǔn)備350份，共3 500個(gè)樣本。

1.2 激光誘導(dǎo)熒光光譜系統(tǒng)

本研究中使用的激光誘導(dǎo)熒光光譜系統(tǒng)示意圖如圖1所示。該系統(tǒng)主要包括激光器(MW-GX-375, 長(zhǎng)春鐳仕)用于發(fā)射波長(zhǎng)為375 nm的激發(fā)光，激光器通過UPS穩(wěn)壓電源(C1K)供電。直徑為1 000 μm的照明光纖(P1000-2-VIS-NIR)用與連接激光器與準(zhǔn)直鏡(COL-20K)，投射出準(zhǔn)直激發(fā)光，垂直入射到植物油樣本表面。植物油樣本用比色皿(24 mm×24 mm×42 mm)裝盛，比色皿放置在升降臺(tái)上。植物油受激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光通過濾光片(LPF400)與準(zhǔn)直鏡(74-UV-02)，以過濾掉強(qiáng)度較大的發(fā)射光及雜散光，通過接收光纖與光譜儀(QE-Pro)以獲取210～980 nm波長(zhǎng)的光譜信號(hào)。

圖1 激光誘導(dǎo)熒光光譜系統(tǒng)示意圖

熒光光譜通過OceanView軟件采集得到，積分時(shí)間設(shè)置為1 000 ms，平滑與平均次數(shù)均為2。每個(gè)樣本采集3次光譜，平均后的光譜為樣本實(shí)際光譜。

1.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

主成分分析法(PCA)，作為一種無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，被用于對(duì)未超標(biāo)(<20 μg/kg)與超標(biāo)(≥20 μg/kg)花生油的聚類趨勢(shì)分析[21]。采用Kennard-Stone算法，將每個(gè)溫度下的植物油樣本的數(shù)據(jù)分別按 3∶1的比例隨機(jī)分成校正集和驗(yàn)證集[22]。分別使用線性判別分析(LDA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)與不同核函數(shù)(Linear, Polynomial, RBF)的支持向量機(jī)(SVM)對(duì)未超標(biāo)與超標(biāo)花生油進(jìn)行判別分析，通過總分類正確率(CCR)、假陽(yáng)性率(FPR)與假陰性率(FNR)對(duì)各模型效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，探索適用于植物油AFB1判別的最優(yōu)建模算法。CCR表示正確預(yù)測(cè)的樣本總數(shù)的百分比。假陰性是指AFB1超標(biāo)樣本被誤判為未超標(biāo)樣本，由于AFB1對(duì)人體危害極大，因此假陰性樣本更應(yīng)該避免。因此，好的模型應(yīng)具有較低的FPR、FNR(尤其是FNR)和較高的CCR[23]。PCA在Unscrambler X (Version 10.4)軟件中進(jìn)行，樣本分組、LDA、PLS-DA與SVM算法建模在Matlab (2019a)軟件中處理。

為了體現(xiàn)溫度對(duì)AFB1預(yù)測(cè)模型的影響，對(duì)分溫度模型與全局模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行比較。分別使用10、20、30、40、50 ℃下的校正集樣本進(jìn)行建模，共建立5個(gè)AFB1判別模型，然后根據(jù)每個(gè)溫度下的校正模型對(duì)本溫度及其他4個(gè)溫度下的驗(yàn)證集進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析分溫度模型對(duì)本溫度與其他溫度下驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)效果，并與全局模型進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜分析

LIF技術(shù)檢測(cè)AFB1的原理是根據(jù)AFB1在紫外光激發(fā)下(340～400 nm)會(huì)發(fā)出藍(lán)色(450 nm)熒光，而G族黃曲霉毒素發(fā)綠色熒光[24]。從圖2可知，在不同溫度下，花生油在400～600 nm波段范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨AFB1含量的增長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì)。表明在溫度恒定的情況下，花生油的熒光強(qiáng)度與AFB1有較強(qiáng)線性關(guān)系。隨著溫度的升高，光譜輪廓形狀無(wú)明顯變化，但熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高會(huì)出現(xiàn)不同幅度降低，基本滿足線性變化。樣本溫度變化不是太大，因此引起熒光強(qiáng)度的降低不是花生油樣本熒光基團(tuán)發(fā)生變化導(dǎo)致的，可能是由于溫度升高，導(dǎo)致花生油的黏度降低，會(huì)發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象[25]。可以確定樣品溫度會(huì)對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響，從而影響模型預(yù)測(cè)效果。為把這種溫度變化對(duì)建立的模型影響降低，常用的方法是建立數(shù)學(xué)模型時(shí)，將溫度變化因素考慮進(jìn)去。即通過建立模型時(shí)加入實(shí)際應(yīng)用中所涉及到的溫度范圍數(shù)據(jù)，降低溫度波動(dòng)對(duì)預(yù)測(cè)模型的影響。

圖2 品牌1花生油在不同溫度下的平均熒光光譜

2.2 PCA結(jié)果

采用PCA對(duì)單個(gè)溫度及不同溫度花生油污染AFB1的熒光光譜數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了聚類分析。圖3是樣本PCA得分圖，無(wú)論單一溫度還是將5個(gè)溫度混合后花生油的AFB1未超標(biāo)樣本和超標(biāo)樣本之間分離趨勢(shì)均不明顯，原因是本研究中所檢測(cè)的花生油樣本有10個(gè)品牌，不同品牌間花生油樣本相關(guān)品質(zhì)有區(qū)別，對(duì)AFB1熒光信號(hào)有一定的干擾，通過PCA得分圖難以將正常樣本與AFB1超標(biāo)樣本精確區(qū)分。后續(xù)采取不同定性建模方法對(duì)正常與AFB1超標(biāo)樣本進(jìn)行判別。

圖3 樣本PC得分圖

2.3 判別結(jié)果

2.3.1 全局模型

基于10、20、30、40、50 ℃，5個(gè)溫度下的校正集樣本建立判別模型，對(duì)5個(gè)溫度下的驗(yàn)證集樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用不同建模方法(LDA、PLS-DA、SVM(Linear)、SVM(Polynomial)與SVM(RBF))對(duì)未超標(biāo)與超標(biāo)花生油進(jìn)行判別分析，400～600 nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度光譜作為模型自變量，通過總分類正確率(CCR)、假陽(yáng)性率(FPR)與假陰性率(FNR)對(duì)各模型效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，不同模型預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示。不同模型校正集和驗(yàn)證集預(yù)測(cè)效果有較大差別，其中SVM(RBF)預(yù)測(cè)效果最好，校正集CCR高達(dá)100%，F(xiàn)PR與FNR均為0，驗(yàn)證集CCR高達(dá)99.66%，F(xiàn)PR為0.60%，F(xiàn)NR為0。LDA與PLS-DA模型效果較優(yōu)，CCR可以達(dá)到80%左右，驗(yàn)證集FNR為27%左右。SVM(Linear)與SVM(Polynomial)效果較差，CCR低于80%，驗(yàn)證集FNR超過33%。由SVM(RBF)建立的溫度全局模型能夠極準(zhǔn)確地對(duì)各溫度下的正常與AFB1超標(biāo)花生油樣本進(jìn)行判別，相對(duì)于其他模型，其CCR提高了超過18%，驗(yàn)證集FNR提高了超過25%。表明徑向基函數(shù)(RBF)作為一種可以解決非線性的映射問題的函數(shù)，可以有效對(duì)不同品牌、不同溫度下花生油樣本的正常與AFB1超標(biāo)樣本進(jìn)行判別。在模型校正過程中，通過交叉驗(yàn)證，確定核函數(shù)最優(yōu)參數(shù)組合為：Kernel參數(shù)=0.2，C懲罰參數(shù)=1，Support Vectors=1 721。

表2 不同建模方法全局模型效果

2.3.2 單溫度模型

為了體現(xiàn)溫度對(duì)AFB1預(yù)測(cè)模型的影響，并根據(jù)全局模型結(jié)果中SVM(RBF)效果最優(yōu)，通過SVM(RBF)并基于各溫度下的校正集樣本建立判別模型。使用各分溫度判別模型對(duì)本溫度與其他4個(gè)溫度下的驗(yàn)證集樣本進(jìn)行AFB1預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 不同溫度下SVM(RBF)分溫度判別模型預(yù)測(cè)AFB1效果

可以發(fā)現(xiàn)各分溫度模型，對(duì)于預(yù)測(cè)本溫度驗(yàn)證集效果極優(yōu)，但是對(duì)于其他4個(gè)溫度下的驗(yàn)證集預(yù)測(cè)效果極差。如10 ℃模型預(yù)測(cè)10 ℃驗(yàn)證集樣本，正確率高達(dá)98.86%，F(xiàn)PR低至0，F(xiàn)NR低至2.67%，當(dāng)該模型預(yù)測(cè)其他4個(gè)溫度驗(yàn)證集樣本時(shí)，CCR只有57%左右或者42%左右，且對(duì)于20 ℃與30 ℃驗(yàn)證集，其FNR超過98%，表明驗(yàn)證集樣本中超標(biāo)樣本絕大部分被誤判成正常樣本，對(duì)于40 ℃與50 ℃驗(yàn)證集，其FPR為100%，表明正常樣本全部被誤判成超標(biāo)樣本。其他溫度分溫度模型預(yù)測(cè)結(jié)果也類似，但對(duì)于不同溫度其FNR與FPR的規(guī)律不相同。可以得出結(jié)論，當(dāng)使用LIF技術(shù)對(duì)花生油樣本AFB1含量進(jìn)行判別時(shí)，需要控制花生油溫度一致，否則將會(huì)出現(xiàn)極大誤差。若檢測(cè)時(shí)，不能達(dá)到控制樣品溫度的條件，可以建立不同溫度的全局模型，提高預(yù)測(cè)精度。

3 結(jié)論

本研究探索了溫度對(duì)AFB1污染的10種不同品牌花生油LIF光譜信號(hào)的影響規(guī)律，結(jié)果表明隨著溫度的升高，光譜輪廓形狀幾乎沒有變化，但熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高會(huì)出現(xiàn)不同幅度降低，表明溫度對(duì)AFB1特征熒光強(qiáng)度有較強(qiáng)干擾。使用5種不同建模方法建立全局模型，通過比較預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SVM(RBF)方法所建立的全局模型預(yù)測(cè)效果最優(yōu)，其正確率超過99%，F(xiàn)NR為0，F(xiàn)PR為0.6%。在此基礎(chǔ)上使用SVM(RBF)建立分溫度模型，并使用各分溫度模型分別對(duì)5個(gè)溫度下驗(yàn)證集進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明各分溫度模型在預(yù)測(cè)本溫度驗(yàn)證集時(shí)，預(yù)測(cè)效果極優(yōu)，正確率均高于97%，驗(yàn)證集FPR與FNR不超過5.5%，但在預(yù)測(cè)其他溫度驗(yàn)證集時(shí)，效果極差。這表明使用LIF技術(shù)檢測(cè)花生油AFB1含量時(shí)，當(dāng)樣本溫度不一致時(shí)，通過建立全局模型能夠提高判別模型的魯棒性。為了更加符合實(shí)際應(yīng)用要求，后續(xù)研究需要針對(duì)自然AFB1污染花生油樣本進(jìn)行檢測(cè)，探索建立適用的、魯棒性強(qiáng)的判別模型。