微生物兩步聯合發酵對豆渣主要營養品質及抗氧化性影響

尹琳琳, 陳華磊, 高俊威, 伍國慶, 譚雨晴, 劉雪婷

(淮南師范學院生物工程學院；資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室1，淮南 232038) (淮南市公安局食品藥品犯罪偵查支隊2，淮南 232000)

豆渣是大豆加工的副產品，每1 kg黃豆加工成豆漿或豆腐，會產生2～3 kg的濕豆渣，產量巨大[1]。因鮮豆渣含水量大(約80%)、粗纖維含量高、口感粗糙且含有蛋白酶抑制劑等抗營養因子，所以易腐敗且不易直接利用，常被簡要熱處理后用于飼料或作廢棄物填埋[2]。而豆渣中含有約10%粗脂肪，55%粗纖維和30%粗蛋白質以及豐富的礦物質、維生素及大豆異黃酮等營養物質(以干基計)[3]。利用霉菌、芽孢桿菌、食用菌等具有產纖維素酶、蛋白酶能力的微生物發酵豆渣可分解粗纖維、粗蛋白等大分子物質，增加可溶性糖、小分肽含量和產生生物活性物質等，以改善豆渣的加工品質和提高其營養價值[4-7]。

隨著對各種微生物應用于豆渣發酵的研究，有研究發現雙歧桿菌、乳酸桿菌、植物乳桿菌等乳酸菌發酵豆類可顯著提升其營養價值，尤其可促使大豆異黃酮單體由糖苷型轉化成人體更易吸收且具有抗氧化、抗腫瘤等高生物活性的苷元型[8-10]。而乳酸菌一般直接利用豆渣基質的能力較弱，目前乳酸菌發酵豆渣基本以酶解法做預處理，但酶解過程條件控制嚴格、成本高且需要對豆渣進行疏松或加水均質等前處理[11]，而具有產纖維素酶、蛋白酶能力的絲狀真菌、芽孢桿菌等可直接對濕基豆渣發酵。因此，可利用微生物發酵替代酶解法對豆渣進行預發酵，且微生物菌群可利用范圍大，發酵條件簡單易控，同時菌體生長中的分解及再合成過程還可產生新的活性成分。目前對微生物聯合乳酸菌發酵豆渣的研究僅有對其膳食纖維的特性及豆渣貨架期變化的研究[12]。

雅致放射毛霉是豆腐乳發酵常用菌種，也是自然發酵霉豆渣中的優勢菌種，具有較強的產纖維素酶、糖化酶能力，可有效提高豆制品中的可溶性膳食纖維和可溶性糖含量[13]；枯草芽孢桿菌具有高產蛋白酶能力，朱運平等[14]發現枯草芽孢桿菌發酵豆渣后其游離氨基酸顯著增加，具有顯著降解大分子物質的能力。因此，兩者均可作為豆渣進行乳酸菌發酵前的預發酵選擇菌種。植物乳桿菌具有抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的作用，具有較強的β-葡萄糖苷酶活性，可促使豆制品中大豆異黃酮的生物轉化作用，且已證明其可在豆制品中發酵[10]，但獨立發酵能力弱，需對豆渣進行酶解預處理。 因此，本研究在前期豆渣發酵菌種選擇及發酵條件優化的基礎上，采用以雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌分別進行豆渣預發酵，然后以植物乳桿菌進行二次聯合發酵，系統分析豆渣聯合發酵前后主要營養物質、關鍵酶活性及抗氧化能力的變化，為功能性豆渣產品的深加工提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣：取自本實驗室豆干加工實驗組；雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)(分離自本地產豆腐乳)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(分離自皖北神仙豆制品)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)由淮南師范學院食品質量與安全實驗室提供；大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素標準品；DPPH自由基清除能力試劑盒；福林酚試劑(生物技術級)、牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(G250)、MRS培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養基、LB培養基(BR級)；乙睛、乙酸、甲醇(色譜級)。

1.2 儀器與設備

FD-2C型真空冷凍干燥機，LDZM-80L-Ⅱ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，DZ500/2D型真空包裝機，D-7型紫外可見分光光度計，HPLC 2998 高效液相色譜(Waters)，250 mm×4.6 mm，5 μm C18 柱，Z-216-M型小型臺式離心機，8400-DK全自動凱氏定氮儀，ZXSD-A1090型生化培養箱。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液及菌懸液的制備

雅致放射毛霉在PDA斜面培養基上活化后，參照譚青云[15]的方法制備10-7～10-8個/mL的孢子懸浮液；枯草芽孢桿菌在LB培養基上活化后，參照朱運平等[14]的方法制備10-6～10-7個/mL的菌懸液；植物乳桿菌在MRS培養基上活化后，參照李偉偉等[12]的方法制備乳酸菌種子發酵液。

1.3.2 微生物兩步聯合發酵豆渣的制備

取新鮮豆渣(含水量約80%)于1 000 mL燒杯中(濕豆渣高度低于2 cm)，8層紗布及牛皮紙密封后于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌20 min，冷卻后進行預發酵，根據本實驗組前期優化的發酵條件：滅菌后豆渣置于大燒杯，雅致放射毛霉接種量為1.5%，16層紗布封口，28 ℃下通風發酵60 h；枯草芽孢桿菌發酵溫度37 ℃，發酵時間36 h，接種量2%，發酵方式同雅致放射毛霉。2種預發酵后豆渣均分為2份，1份直接進行冷凍干燥(雅致放射毛霉預發酵豆渣記為A組，枯草芽孢桿菌預發酵豆渣記為B組)，備用；另1份于121 ℃，20 min滅菌，冷卻后分別接種植物乳桿菌種子發酵液2%，在37 ℃下密封，靜置發酵48 h(預實驗發現在該條件下菌體繁殖快，48 h后趨于穩定，未檢測到雜菌)后直接冷凍干燥(雅致放射毛霉+植物乳桿菌發酵豆渣記為AL組，枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌發酵豆渣為記BL組)，備用；未發酵豆渣(接種2%滅菌蒸餾水同步培養)作對照記為CK組。

1.3.3 發酵豆渣基本營養成分測定

粗脂肪的測定：參照GB 5009.6—2016；蛋白質的測定：參照GB 5009.5—2016；纖維素的測定：采用范氏(Van Soest)纖維測定法[14]；可溶性總糖的測定：采用苯酚-硫酸法測定[16]；可溶性蛋白質的測定：采用考馬斯亮藍法測定[17]。

1.3.4 發酵豆渣主要活性物質測定

1.3.4.1 小肽含量的測定

利用三氯乙酸做沉淀劑，去除蛋白質和長肽鏈的原理，具體參照李慧娟等[18]的方法并稍作調整。稱取1 g凍干豆渣加入50 mL 15%的三氯乙酸溶解，并定容至100 mL，于6 000 r/min離心15 min后，取上清液10 mL，進行消化及凱氏定氮法測定其氮含量，且同法測定凍干豆渣的含氮量。小肽含量依據式(1)計算。

(1)

1.3.4.2 總酚含量的測定

參照VOSS等[19]所采用福林酚試劑法，并稍作修改。稱取1 g凍干豆渣樣品，用70%乙醇定容至100 mL，4 500 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入5 mL蒸餾水，1 mL 0.2 mol/L福林酚溶液，混勻后靜置5 min，再加入3 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，避光靜置2 h，于760 nm 處測定吸光值。豆渣中總酚含量以一水沒食子酸當量(Gallic Acid Equivalent，GAE)(mg GAE/g，凍干豆渣粉)計。一水沒食子酸標準溶液(濃度范圍為0～6 mg/mL)制作的標準曲線為y=0.134 1x-0.001 5，R2=0.999)。

1.3.4.3 大豆異黃酮的測定

根據GB/T 26625—2011高效液相色譜法測定。檢測條件為色譜柱：RPC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：0.1%乙酸乙腈溶液，B：0.1%乙酸溶液；流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測器：紫外檢測器；波長：260 nm，梯度洗脫程序詳見。以大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素標準品制作的標準曲線見表1。稱取0.2 g凍干豆渣置于5 mL容量瓶中，加入3 mL 80%甲醇溶液，超聲提取30 min后，再用80%甲醇溶液定容，混勻后轉移至5 mL離心管中，5 000 r/min，離心10 min，取上清液2 mL，過0.22 μm微孔濾膜后進樣。根據表1計算出豆渣樣品中大豆異黃酮各組分含量，結果以mg/kg(以凍干豆渣計)表示。

表1 大豆異黃酮標準品的標準曲線

1.3.5 發酵豆渣抗氧化活性測定

DPPH自由基清除活性的測定：采用DPPH自由基清除能力試劑盒法測定，根據Trolox標準濃度梯度制作的標準曲線(y=3.196 1x+0.941，R2=0.998)，計算豆渣樣品清除DPPH自由基的能力，結果以μg Trolox/g(以凍干豆渣計)表示。

總還原力(FRAP)的測定：參照Ge等[20]的方法，以mmol FeSO4/g(以凍干豆渣計)表示。

1.3.6 發酵豆渣主要酶活性測定

1 g凍干豆渣置于20 mL pH 5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，磁力攪拌30 min，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，上清液則為粗酶液。纖維素酶活性測定參照吳永祥等[5]方法，纖維素酶活力(U)單位定義為在 37 ℃下，pH 5.0時每分鐘水解生成 1 μg 葡萄糖所需的酶質量。β-葡萄糖苷酶活性測定參照曾子毅等[21]方法，β-葡萄糖苷酶活力(U)單位定義為在 37 ℃， pH 5.0 時 每分鐘催化生成1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。蛋白酶活性測定過程參照管瑛等[17]方法，粗酶液制備：稱取1g凍干豆渣，加入20 mL蒸餾水中，室溫下1 h后，于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，上清液則為粗酶液，蛋白酶酶活力單位(U)定義：40 ℃，pH 7.5時每分鐘從可溶性酪蛋白中水解生成1 μg酪氨酸所需要的酶量。

1.4 數據處理

每個樣品重復3次，結果以平均值±標準差表示。 采用SPSS17.0軟件對結果進行顯著性和pearson相關性分析，選取P<0.05為顯著水平，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵豆渣基本營養成分變化

發酵前后凍干豆渣中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、可溶性總糖和可溶性蛋白質含量變化見表2。與CK組相比，A組和B組的粗纖維含量由55.62 g/100 g分別降至48.41、52.38 g/100 g，粗蛋白、可溶性總糖和可溶性蛋白質均顯著增加(P<0.05)，粗脂肪增加不顯著(P>0.05)。AL組、BL組與A組、B組相比，粗纖維和可溶性總糖均有顯著降低(P<0.05)，粗蛋白、粗脂肪和可溶性蛋白均有增加(P<0.05)。這與朱運平、管瑛等[14,17]對不同菌種發酵豆渣基本營養成分的變化規律相近。粗纖維含量的降低是由于微生物分泌的纖維素酶作用，使大分子纖維降解溶出小分子糖類，使可溶性糖的測定值顯著增加，而AL與BL組可溶性總糖的含量降低，可能由于植物乳桿菌在生長繁殖過程中需要不斷消耗可溶性糖類，降解纖維素的能力較弱，從而消耗了預發酵產生的可溶性糖類所致。粗蛋白與可溶性蛋白含量均有增加與菌體生長過程中分泌物質轉化和蛋白酶有關[1]。

表2 發酵豆渣基本營養成分變化(以凍干豆渣計)

2.2 發酵豆渣主要酶活性變化

對豆渣經預發酵與聯合發酵前后的纖維素酶、蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性進行了比較，結果見圖1。與CK組相比，豆渣的纖維素酶和蛋白酶活性經預發酵后顯著增加(P<0.05)，β-葡萄糖苷酶活性變化不顯著(P>0.05)。預發酵豆渣滅菌后其殘存酶活性與發酵前無明顯差異，與預發酵滅菌后豆渣相比，AL組與BL組的纖維素酶和蛋白酶活性增加，但升高幅度明顯低于預發酵組，而β-葡萄糖苷酶活性顯著提高(P<0.05)。結果顯示，豆渣經2種微生物預發酵后均可產生高活性的纖維素酶和蛋白酶，但雅致放射毛霉的產纖維素酶能力顯著高于枯草芽孢桿菌，后者的產蛋白酶活力更強。植物乳桿菌聯合發酵可使預發酵滅菌后豆渣中的β-葡萄糖苷酶活性顯著增加(P<0.05)，纖維素酶和蛋白酶活性提高幅度較小。張哲等[22]發現不同來源植物乳桿菌均具有產β-葡萄糖苷酶活性，黃玉軍等[23]以β-葡萄糖苷酶作用增加大豆異黃酮苷元的能力為參照，檢測到植物乳桿菌在優化豆乳中具有高產該酶活性，本研究中植物乳桿菌可在預發酵后豆渣中大量繁殖，利于其產生相應酶。

注：相同指標不同字母表示變化差異顯著(P<0.05)，余同。圖1 發酵豆渣纖維素酶、蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性變化情況

2.3 發酵豆渣小肽含量的變化

小肽具有抗氧化、抑制血管緊張素轉化酶活性和減弱蛋白抗原等功能，可由蛋白酶水解蛋白質產生，微生物可分泌蛋白酶且可將直接產生的小肽通過重排、移接等再加工方式，修飾不良基團，使小肽具有更高的應用價值[24]。圖2為豆渣經預發酵及聯合發酵前后的小肽含量變化。與CK組相比，B組與BL組發酵豆渣的小肽含量分別增加至7.71%和10.22%，A組與AL組升高幅度較小，結合圖1，這與雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力差異有關。有研究發現枯草芽孢桿菌發酵豆類時具有較強分解蛋白質產小肽的能力[17]。結合圖1植物乳桿菌也具有一定的產蛋白酶能力，可促使預發酵滅菌后的豆渣中蛋白質的分解，從而使小肽含量有一定增加。

圖2 發酵豆渣小肽含量變化情況

2.4 發酵豆渣總酚含量的變化

酚類物質與植物的抗氧化能力密切相關，圖3表明A組和B組豆渣中總酚含量分別增加至24.25、19.12 mg/g，而經植物乳桿菌聯合發酵后，與A組、B組相比，AL組和BL組中總酚含量顯著降低(P<0.05)，仍顯著高于CK組。Singh等[25]利用真菌和芽孢桿菌發酵豆制品中總酚含量增加了約5倍，與本實驗預發酵組結果一致，可能由于微生物發酵豆渣產纖維素酶使其纖維結構松散化，比表面積增加，促進了酚類物質從纖維結構中釋放出來，從而使可檢測總酚含量升高[1]。植物乳桿菌聯合發酵后總酚含量降低，與乳酸菌產纖維素酶能力弱，從豆渣中釋放酚類物質的能力差，且代謝過程有較大消耗有關，Glenise等[26]研究雙歧桿菌和乳酸桿菌對酶解豆渣中生物活性物質影響，發現發酵后豆渣中多酚含量降低約30%。

圖3 發酵豆渣中總酚含量變化情況

2.5 發酵豆渣中大豆異黃酮含量變化

大豆異黃酮是大豆中的重要次級代謝物，主要以糖苷型(以大豆苷、大豆黃苷和染料木苷為主)和苷元型(以大豆苷元、大豆黃素和染料木素為主)的形式存在為主。天然狀態下，大豆中的大豆異黃酮一般以糖苷型存在，而大量研究表明苷元型大豆異黃酮更易被人體吸收和具有更高的生物活性[27]。豆渣中的大豆異黃酮含量一般在豆類原始異黃酮質量分數的12%～40%之間，且豆渣中的苷元型大豆異黃酮含量多于豆漿[1]。

檢測微生物聯合發酵前后豆渣中大豆異黃酮的大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、大豆黃素和染料木素6種主要成分變化，結果見圖4。CK組豆渣中大豆異黃酮主要以糖苷型為主，含量為146.51 mg/kg，苷元型含量僅為45.8 mg/kg。A組和B組的糖苷型大豆異黃酮含量分別下降了16.2%和21.6%，而苷元型含量則顯著升高，且經AL組和BL組聯合發酵后的豆渣大豆異黃酮的此變化更為顯著。其中，AL組和BL組中糖苷型大豆異黃酮含量分別降低了83.4%和89.9%，苷元型含量比各預發酵組分別升高了2.2倍和2.3倍。結果表明，雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌預發酵和植物乳桿菌聯合發酵均能促使豆渣中大豆異黃酮糖苷型向苷元型的轉化，且植物乳桿菌的轉化能力更強，尤其是大豆苷和染料木苷經聯合發酵后含量很低，在BL組兩者均檢測不到，但對大豆黃苷的轉化能力較弱，這與Glenise等[26]研究乳酸菌發酵豆渣中大豆異黃酮的結果一致，并發現乳酸菌可產生β-葡萄糖苷酶將糖基部分從糖苷型大豆異黃酮中移除，從而使其轉化成相應的苷元型。而發酵后豆渣中的大豆異黃酮總含量降低，可能與發酵過程中部分大豆異黃酮苷元轉化為其終產物-雌馬酚[28]。

圖4 發酵豆渣中糖苷型大豆異黃酮(Ⅰ)和苷元型大豆異黃酮(Ⅱ)含量變化情況

表3 發酵豆渣小肽、總酚、糖苷型大豆異黃酮、苷元型大豆異黃酮與抗氧化能力相關性

2.6 發酵豆渣抗氧化特性的變化及其與大豆異黃酮的相關性分析

通過對FRAP鐵離子還原力和DPPH自由基清除能力的檢測來分析豆渣發酵前后的抗氧化能力變化及其大豆異黃酮的相關性，結果見圖5和表3。A組和B組預發酵后豆渣的總還原力分別為CK組的2.56倍和2.35倍，DPPH自由基清除能力為1.61倍和2.25倍；經AL和BL聯合發酵后總還原力在預發酵的基礎上提高了15.7%和20.8%，DPPH自由基清除能力提高了115.9%和90.8%，可見雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌預發酵對豆渣總還原力的提升能力較強，而植物乳桿菌聯合發酵對其DPPH自由基清除能力的提升更為顯著(P<0.05)。這可能與預發酵對大分子物質的降解，為植物乳桿菌在豆渣中生長代謝提供了有利條件，產生了高活性β-葡萄糖苷酶，促進了苷元型大豆異黃酮的產生有關。

圖5 發酵豆渣抗氧化特性變化情況

因此，對豆渣的FRAP鐵離子還原力和DPPH自由基清除能力與其大豆異黃酮各組分之間的相關性進行了分析，通過表3中的Pearson相關性檢驗結果可以看出，豆渣中的苷元型大豆異黃酮大豆苷元和染料木素與其DPPH自由基清除能力均呈極顯著正相關(P<0.01)，且大豆苷元還與FRAP鐵離子還原力呈顯著正相關(P<0.05)，而大豆黃素與兩者之間均不相關。糖苷型大豆異黃酮大豆苷和染料木苷與DPPH自由基清除能力均呈顯著負相關(P<0.05)。說明發酵豆渣FRAP鐵離子還原力和DPPH自由基清除能力提高與大豆異黃酮由糖苷型向苷元型轉化密切相關。

3 結論

豆渣經預發酵和聯合發酵后因菌體生長中的代謝作用，使豆渣的基本成分的含量和比例構成發生了明顯變化，粗纖維顯著降低，可溶性蛋白質、粗蛋白均有增加，且聯合發酵效果更為顯著；豆渣中小肽含量和總酚含量經兩種預發酵均升高，聯合發酵后小肽含量繼續增加，而總酚含量呈顯著降低，這與豆渣中纖維素酶和蛋白酶活性變化有關。發酵對豆渣中大豆異黃酮的單體存在形式影響顯著，尤其經聯合發酵后糖苷型大豆苷和染料木苷低于檢測限，轉化為相應的苷元型大豆苷元和染料木素，與植物乳桿菌聯合發酵產β-葡萄糖苷酶活力較強有關。經相關性分析發現，豆渣中大豆異黃酮的生物轉化與其抗氧化能力密切相關。因此，雅致放射毛霉和枯草芽孢桿菌預發酵和植物乳桿菌聯合發酵均對豆渣主要營養成分的構成和抗氧化特性有明顯改善，植物乳桿菌聯合發酵后豆渣的大豆異黃酮可更有效的轉化為利于人體吸收和生物活性更高的苷元形式，營養物質構成更為合理且抗氧化能力提升更顯著。