微波預處理對油茶籽毛油抗氧化性的影響

王龍祥， 羅 凡， 許曉君， 杜孟浩， 方學智， 鐘海雁

(中南林業科技大學食品科學與工程學院1，長沙 410004) (中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所2，杭州 311400)

關鍵字：油茶籽油；微波；總酚；美拉德產物；DPPH

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)常綠小喬木或灌木，是我國特有的經濟效益和生態效益俱佳的木本油料物種,廣泛種植于我國南方各省[1]，尤其是在湖南省,油茶籽油占湖南省植物用油的50%以上[2]。截止到2020年，我國油茶籽種植面積達6 800萬畝，茶油產量約為62.7萬t，油茶產業總產值達1 160億元。

油茶籽油是從油茶籽仁中提取出來的植物油，其營養豐富，含有多酚、角鯊烯[3]、甾醇[4]等多種天然抗氧物質，且有些油茶籽油經過高溫預處理時會產生美拉德產物等抗氧化物質。茶油的抗氧化性一直是油茶研究的一個熱點。目前油茶籽油具有較好穩定性的主要機理還未達成共識，油茶籽油的氧化穩定性可能是多酚、美拉德產物等物質的共同作用的結果[5]。

多酚是國內外研究油茶籽油抗氧化性能時分析最多的一種抗氧化物，油茶籽油的保健功能與其有密切關系[6]。劉靂等[7]證實了油茶籽毛油中極性酚類物質的存在，且確定該物質與油茶籽油儲藏穩定性有關。李志曉[8]發現多酚含量與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)陽離子自由基清除能力和鐵離子還原能力(FRAP)極顯著相關。劉靜等[9]發現油茶籽油的抗氧化活性和防紫外輻射活性與多酚含量相關。這也與“極性悖論”假說有相通之處，“極性悖論”認為極性強的抗氧化劑往往在油脂體系中能表現出更強的抗氧化活性，因為油脂體系中極性強的抗氧化劑容易被排斥到油氣界面從而保護油脂[10]。

美拉德反應，即羰氨反應，是由Hodge[11]提出的較為復雜的氨基化合物和糖基化合物之間的反應。其反應較為復雜，故產物也較多且有些產物具有一定的抗氧化性，如羥甲基糠醛[12]、α-羰基化合物[13]等等。5-羥甲基糠醛(5-HMF)是羥甲基糠醛的代表物質之一，是美拉德反應的重要中間產物，是褐變的指標成分之一，且具有一定的抗氧化作用[14]。丙酮醛(MGO)、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)是美拉德反應中級階段產生的α-二羰基化合物，具有較高的活性。丙酮醛是一種小分子的高活性二羰基復合物，在美拉德反應中其產生于中級階段Amadori重排后分解所產生，具有抗腫瘤[15]等活性作用。3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)是美拉德反應中產出的一種高反應性中間產物[16]。這幾種α-羰基化合物都是美拉德風味和色澤的重要前體，具有活性高、穩定性低的特點[17]。

在油茶籽預處理中，微波預處理是一種較為新的預處理方式，其是利用高頻電磁場快速改變產生能源，物質吸收微波能量后通過分子的震動摩擦將能量轉化為熱能。這種加熱的方式具有高效節能、清潔無污染的特點[18]。微波預處理后是否引起油茶籽油的抗氧化能力顯著變化，其內部抗氧化物質的含量及抗氧能力是否發生顯著改變，這對研究油茶籽油的氧化穩定性具有重要意義。

本實驗以油茶籽仁為原料，經微波預處理測定油茶籽毛油DPPH、總酚含量及抗氧化能力和美拉德產物的含量，分析微波預處理對油茶籽毛油中抗氧物質的影響，為油茶籽毛油氧化穩定性規律提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料處理與提取

油茶籽清理除去未成熟、破損和霉變粒后，經測定[19]其含水率為(8.81±0.04)%，油茶籽仁含油率為(37.14±1.09)%。

油茶籽仁處理：油茶籽一定條件微波預處理后剝殼得到油茶籽仁，通過液壓榨取油茶籽毛油，冷藏備用。樣品處理條件如表1所示。各功率加熱最大時間時溫度依次為120、140、190、220 ℃。

表1 樣品處理條件

DPPH測定茶油全油樣品制備：參照文獻[20]方法，略做改動：稱取0.5 g油茶籽毛油，乙酸乙酯定容。

總酚樣液提取：采用固相萃取提取油茶籽毛油中的總酚[21]。

美拉德產物提取[22]：稱取5 g油茶籽毛油，用甲醇萃取3次后定容至10 mL，冷藏備用。

1.2 試劑與儀器

二醇基固相萃取柱(500 mg·3 mL-1)，福林酚、2,2-聯苯基-1-苦基肼基(96%，DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(99%，TPTZ)、2 ,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(98%，ABTS)、丙酮醛(MGO)、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)、5-羥甲基糠醛(5-HMF)、水溶性維生素E(97%，Trolox)、過硫酸銨、無水碳酸鈉、沒食子酸、乙酸乙酯、無水乙酸鈉、冰乙酸、濃鹽酸、氯化鐵、鄰苯二胺、氫氧化鈉、無水乙醇，均為分析純；正己烷、甲醇為色譜純。

S-114分析天平，Agilent LC1260Ⅱ液相色譜儀，P70F20L-DG(S0)微波爐，6YY-190自動液壓榨油機，Q-101平行蒸發儀，Avanti J-E冷凍離心機，UV-2550紫外可見光分光光度計。

1.3 方法

油茶籽毛油DPPH測定：參考文獻[23]并略做改動，定容后取1 mL，與3 mL DPPH乙酸乙酯溶液混合避光反應2 h，517 nm測定吸光值，以Trolox為標準物，繪制標準曲線，DPPH測定能力以μg TE/g表示[24]。

總酚測定：參考文獻[25]，并略作調整，取1 mL樣品于10 mL具塞試管內，加入5 mL 10%福林酚試劑，反應8 min 后再分別加入4 mL 7.5% Na2CO3，振蕩10 s后室溫下靜置1 h，765 nm 處測定吸光度，以沒食子酸為標準物，測定標準曲線，樣品濃度以沒食子酸濃度計算，以μg GAE/g表示。

總酚ABTS測定：參考文獻[26]，略作調整，移取樣品0.5 mL總酚樣液于10 mL刻度試管中，加入ABTS工作液3.5 mL，設置空白，空白中1 mL水代替樣液，30 ℃水浴6 min，在734 nm波長處測定吸光值，以Trolox為標準物，繪制標準曲線，DPPH測定能力以μg TE/g表示。

總酚FRAP測定：參照文獻[27]，并略作調整，移取0.2 mL總酚樣液和3.8 mL FRAP溶液混合后，37 ℃水浴黑暗狀態下放置30 min，在593 nm處測定其吸光度值，以Trolox為標準物，繪制標準曲線，DPPH測定能力以μg TE/g表示。

美拉德產物(5-羥甲基糠醛、丙酮醛、3-脫氧葡萄糖醛酮)測定：結合文獻[28，29]并參照課題組之前方法[30]，進行測定。

5-羥甲基糠醛的高效液相色譜檢測條件：流動相A：0.1%冰醋酸溶液，流動相B：甲醇，流速0.7 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣量：10 μL，檢測波長280 nm，色譜柱型號：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測器：SPD紫外檢測器，時間程序如表2所示。

表2 5-羥甲基糠醛的液相色譜洗脫程序

3-脫氧葡萄糖醛酮、丙酮醛的高效液相色譜檢測條件：流動相A：0.1%冰醋酸溶液，流動相B：甲醇，流速：0.8 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣量：10 μL。檢測波長314 nm，色譜柱型號：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測器：SPD紫外檢測器，時間程序如表3所示。

表3 二羰基化合物的液相色譜洗脫程序

1.4 數據處理方法

所有數據采用Microsoft Excel 2007、SPSS 22、Origin 9進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 油茶籽毛油的DPPH含量分析

自由基氧化是常見的食用油氧化原因之一，DPPH自由基清除能力來評價抗氧活性已作為常用標準[31]。微波預處理油茶籽毛油DPPH含量變化如圖 1所示。油茶籽毛油中DPPH清除自由基能力受微波處理影響顯著。微波功率在420 W時DPPH隨時間變化不顯著(P>0.05)，但在245、560、700 W時，其含量隨著時間變化顯著增加(P<0.05)。DPPH含量最高為700 W 20 min處，為(337.08±6.07) μg TE/g，是初始含量(232.40±4.74) μg TE/g的1.45倍，最低為700 W、5 min處，為(204.55±9.63) μg TE/g，是初始含量的0.88倍。推測初始微波加熱時間較短，油茶籽油抗氧物質以消耗為主，隨著時間和微波功率的增加，抗氧物質逐漸從細胞中溶出，使得DPPH增加。此外，也可能有非抗氧物質的轉化使DPPH逐漸升高。

圖1 油茶籽毛油中DPPH的含量變化

2.2 總酚含量及抗氧能力分析

2.2.1 總酚含量

微波預處理油茶籽毛油中總酚含量的變化情況如圖2所示。油茶籽毛油中總酚含量受微波功率影響顯著(P<0.05)。 推測短時微波加熱能夠直接破壞細胞壁結構，使得油中酚類物質更加容易溶出[32]，且隨著時間的延長除了酚類的溶出還有可能一些其他非酚類物質轉化為酚類物質，使得總酚含量增加較快。由圖2可看出，最高值為700 W 20 min處，為(193.04±9.38)μg GAE/g，為初始(5.13±1.04)μg GAE/g的37.63倍；最低值為245 W 5 min處，(4.43±0.36)μg GAE/g，為初始的0.86倍，推測可能由于初始功率較低，總酚含量因多酚氧化消耗導致含量降低，但隨著酚類物質溶出會使得總酚含量逐漸升高。245、420、560、700 W的功率下20 min處為最大值，含量分別為245 (12.25±0.86)、(37.66±0.85)、(137.89±6.22)、(193.04±9.38)μg GAE/g，最高與最低相差15.76倍。此外發現700 W 10 min處總酚的含量有降低再增加的過程，推測是由于功率較高，使得初期總酚的消耗較大，但隨著時間增加多酚物質溶出和非酚類物質轉化又使得總酚含量增加。這與羅凡等[33]研究結果相一致。

圖2 油茶籽毛油中總酚含量變化

2.2.2 總酚中ABTS分析

微波預處理油茶籽毛油總酚中ABTS含量變化如圖3所示。油茶籽毛油中總酚ABTS受微波功率影響顯著(P<0.05)。推測微波功率增加使得總酚溶出率增加導致ABTS增加[34]。ABTS含量最高值為700 W 20 min處，為(192.57±3.71)μg TE/g，是初始值(8.44±0.28)μg TE/g的22.82倍，最低為初始值。每個功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(26.95±1.18)、(75.24±8.97)、(187.15±4.41)、(192.57±3.71)μg TE/g，最高與最低相差7.14倍。此外發現700 W 10 min處含量有先降低再升高的現象，這與總酚含量變化類似，經測定ABTS含量與總酚含量具有顯著相關性(P<0.05),線性相關系數為0.98，這與李志曉[8]研究結果相一致，因此總酚含量降低使得ABTS降低。

圖3 油茶籽毛油總酚中ABTS含量變化

2.2.3 總酚的FRAP分析

微波預處理油茶籽毛油總酚FRAP含量變化如圖4所示。油茶籽毛油中總酚FRAP受微波功率影響顯著(P<0.05)。推測微波預處理屬于內部加熱方式，處理使得細胞壁結構直接破壞導致溶出率升高，進而總酚含量升高，使得FRAP含量增加[35]。FRAP含量最高值為700 W 20 min處，為(295.32±14.11)μg TE/g，是初始含量(4.33±1.62)μg TE/g的68.2倍，最低值為初始值。每個功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W下含量分別為(23.57±0.32)、(72.92±1.47)、(225.98±16.93)、(295.32±14.11)μg TE/g，最高與最低相差12.53倍。且對比發現，總酚對FRAP的清除能力與ABTS清除能力存在差異，這也說明多酚對不同抗氧化機制的影響程度也不同。

圖4 油茶籽毛油中FRAP的含量變化

2.3 美拉德產物含量分析

2.3.1 5-HMF含量分析

微波預處理油茶籽毛油5-HMF含量變化如圖5所示。油茶籽毛油中5-HMF受微波功率影響顯著(P<0.05)。這與江姍姍等[36]研究相一致。5-HMF含量最高為560 W 20 min 處，為(26.76±1.46)μg/g，是初始含量(4.21±0.03)μg/g的6.36倍，最低值為420 W 10 min 處，為(3.99±0.01)μg/g，為初始含量的0.95倍。每個功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(4.60±0.02)、(10.49±0.10)、(26.76±1.46)、(21.34±0.32)μg/g，最高與最低相差5.82倍。推測微波預處理初期，油茶籽細胞壁較難破壁，5-HMF較難溶出，隨著微波功率增加和時間延長，5-HMF逐漸溶出和一些其他物質轉化生成使得其含量增加。但在微波功率為700 W 20 min時發現，其含量小于560 W，推測高功率下，5-HMF隨時間延長進一步反應生成糖醛或者類黑素使其含量降低[37]。因此，5-HMF的最適條件為560 W 20 min。

圖5 油茶籽毛油中5-HMF的含量變化

2.3.2 MGO含量分析

微波預處理油茶籽毛油MGO含量變化如圖6所示。油茶籽毛油中MGO受微波功率影響顯著(P<0.05)。MGO含量最高為700 W 20 min處，為(13.60±2.18)μg/g，是初始含量(1.22±0.01)μg/g的11.15倍，最低為245 W 5-15 min、420 W 10 min處，低于檢測限；每個功率下在20 min處具有最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(1.60±0.08)、(4.04±1.16)、(6.72±0.27)、(13.60±2.18)μg/g，最高與最低相差8.5倍。推測MGO作為美拉德反應中級階段strecker裂解的二羰基產物之一[38]，初期微波頻率較低時間較短，MGO參與美拉德下一步反應生成醛醇類或脫氮聚合物等使得含量降低[39]，隨著功率增加和時間的延長，MGO含量伴隨美拉德反應逐漸增加[40]。因此，MGO的最適功率為700 W 20 min。

2.3.3 3-DG含量分析

圖6 油茶籽毛油中MGO的含量變化

微波預處理油茶籽毛油3-DG含量變化如圖7所示。油茶籽毛油中3-DG受微波功率影響顯著(P<0.05)。3-DG含量最高值在700 W 20 min處，為(75.46±3.79)μg/g，是初始值(2.52±0.12)μg/g的29.94倍，最低為245 W 15 min處，為(2.00±0.26)μg/g，是初始值的0.79倍。每個功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(4.34±0.14)、(24.44±6.49)、(73.16±3.69)、(75.46±3.79)μg/g，最高與最低相差17.39倍。推測3-DG作為美拉德反應中高反應性中間產物，由于初期微波功率較低和時間較短，3-DG參與美拉德下一步反應生成酮亞胺類使得含量降低，隨著功率增加和時間延長，3-DG隨著美拉德反應含量逐漸增加[41]。因此，3-DG的最適功率為700 W 20 min。

圖7 油茶籽毛油中3-DG的含量變化

3 結論

以油茶籽仁為原料，研究微波預處理對油茶籽毛油抗氧物質的影響。結果表明微波預處理對油茶籽油抗氧能力具有顯著性影響。油茶籽油DPPH自由基清除能力在700 W 20 min處有最大值，為(337.08±6.07)μg TE/g。微波預處理對總酚含量及其抗氧化性具有顯著影響，多酚對ABTS陽離子自由基清除能力小于鐵離子還原能力。在700 W 20 min時多酚含量及抗氧能力最高，為(193.04±9.38)μg GAE/g，總酚ABTS為(192.57±3.71)μg TE/g，FRAP為(295.32±14.11)μg TE/g。微波預處理對美拉德產物含量具有顯著影響，美拉德產物隨著微波功率增加而增加。5-HMF在560 W 20 min處有最大值(26.76±1.46)μg/g，二羰基產物在700 W 20 min有最大值MGO 為(13.60±2.18)μg/g，3-DG為(75.46±3.79)μg/g。

油脂抗氧化機制是一個比較復雜的過程，油茶籽油的氧化穩定性可能是多酚、美拉德產物、甾醇和角鯊烯等抗氧物質共同作用的成果，但如何相互作用需進一步研究。