玉米醇溶蛋白/多糖基復合抗菌膜的制備及性能表征

王欣卉， 程 紅， 陳佳鵬， 王韻儀， 任 健， 宋春麗， 宋雪健

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院1，齊齊哈爾 161006) (黑龍江八一農墾大學食品學院2，大慶 163319)

玉米黃粉是利用玉米在釀酒、制備淀粉糖等精深加工過程中產生的富含蛋白質廢料，目前，常將含有60%蛋白質的玉米黃粉作為動物飼料的，導致其應用附加值極低[1]。玉米黃粉中的50%～70%的蛋白質為Zein，它是多種蛋白組成的混合物，平均分子質量為25～45 ku，主要包括α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白及δ-玉米醇溶蛋白，其中α-玉米醇溶蛋白占比75%～85%，易溶于95%的乙醇；β-玉米醇溶蛋白占比10%～15%，易溶于60%的乙醇，其余2種蛋白含量相對較低[2]。Zein作為食品藥品監督管理局(FDA)認定的食品加工原料，其分子間的二硫鍵和疏水性氨基酸構成的復合結構，具有良好的生物相容性、可降解、溶解性及成膜性[3]。因此，Zein多被應用于醫療、食品、包埋等領域[4-6]。目前玉米醇溶蛋白的制備工藝主要有冷凍沉淀技術、凝膠色譜法、超臨界CO2萃取技術、膜分離技術等[7]。

玉米醇溶蛋白因其無毒無害、透明、阻油、防紫外線、不需要交聯劑可以單獨成膜，是理想的綠色環保包裝材料，但是以單一成分制備的玉米醇溶蛋白膜，脆性和穩定性價差。因此，對玉米醇溶蛋白膜的改性研究極為重要。甘油等低分子質量增塑劑能夠在一定程度上降低玉米醇溶蛋白膜中聚合物分子間的作用力，進而增加膜的柔韌性，改善膜的易脆性[8]。多糖類物質因其容易獲取，結構穩定，易于成膜等優點而常被應用于復合膜的改性研究中。將玉米醇溶蛋白和殼聚糖進行復合制備的薄膜具有較好的阻隔性和力學性能，玉米醇溶蛋白還可以改善明膠膜的延展性[9,10]。黃煜凱[11]研究發現隨殼聚糖濃度的增大Zein/殼聚糖復合膜的水蒸氣透過率呈現先減小后增大的趨勢。在殼聚糖質量分數為3.5%時，復合膜的水蒸氣透過率達到最低值，因此可以根據殼聚糖的濃度來改良玉米醇溶蛋白膜水蒸氣透過性。王大鵬等[12]研究發現隨著明膠濃度的增加，Zein/明膠納米纖維的直徑的增加顯著增加。進而說明了利用明膠對Zein進行改性后的復合膜在生物活性傳遞及對抗菌劑的控釋方面具有潛在的應用前景。

天然生物抗菌劑納他霉素(Natamycin)和乳酸鏈球菌素(Nisin)具有高效、廣譜、安全的抑菌功能，被廣泛應用于抗菌膜的研究中。Mo等[13]制備了負載納他霉素的玉米醇溶蛋白/酪蛋白復合納米顆粒，并將其加入明膠膜中，以改善膜的物理化學和抗真菌性能，結果發現，該抗菌膜對黑曲霉、灰霉病菌和桔青霉具有較強的抗真菌活性。Hager等[14]將Nisin添加到Zein中制備成涂膜液，對魚片進行保鮮研究發現，在保藏期內該方法可以有效地減低魚片中李斯特菌的滋生。納他霉素對真菌具有一定的抑制作用，但對細菌并無抑菌效果，而Nisin對細菌(革蘭氏陽性菌)具有應的高效的抑制效果，而導致食品腐敗變質的微生物包括細菌和真菌，因此對其共同抑制來延長食品的貨架期極為重要。因此，研究采用玉米醇溶蛋白作為主要的成膜基材，通過與多糖類物質瓊脂和卡拉膠進行復配，并將天然生物抗菌劑納他霉素和Nisin作為抗菌劑來制備綠色環保抗菌包裝材料，有利于拓寬玉米醇溶蛋白的開發與利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米醇溶蛋白粉(含蛋白質92.3%)、瓊脂、卡拉膠、甘油、納他霉素、乳酸鏈球菌素、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、無籽葡萄。

1.2 實驗設備

XLW型智能電子拉力試驗機， BYT-B1型透氣性測試儀，TSY-T1H透濕性測試儀， THZ-82A水浴恒溫振蕩器， LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，CR-400/410色彩色差儀， DMN型光澤度儀， WGT-S透光率/霧度測定儀， 2WAJ阿貝折射儀。

1.3 復合抗菌膜的制備

玉米醇溶蛋白膜的制備參考任聰等[15]研究方法。實驗采用2%(單一干物質占乙醇溶液的比例，下同)的玉米醇溶蛋白，1%的甘油，0.25%的明膠，0.02%的納他霉素，0.05%的乳酸鏈球菌素，分別與1%的卡拉膠、1%的瓊脂及1%的瓊脂/卡拉膠(1∶1)在80 ℃的水浴條件下，用200 mL體積分數為85%的乙醇溶液進行共混，待其充分溶解后流延于23×30 cm的玻璃板上，并于37 ℃的條件下干燥10 h，進而來制備玉米醇溶蛋白-卡拉膠復合抗菌膜(Ze-CA)，玉米醇溶蛋白-瓊脂復合抗菌膜(Ze-AG)，玉米醇溶蛋白-卡拉膠/瓊脂復合抗菌膜(Ze-CA/AG)，將制備好的復合抗菌膜于30%～50%的相對濕度條件儲藏。

1.3.1 復合抗菌膜的性能表征1.3.1.1 厚度測試

1.3.1.2 水溶性測試

在60 ℃的條件下將復合抗菌膜裁剪成2 cm×2 cm大小的正方形干燥至恒質量M1，置于50 mL的蒸餾水中，浸泡15 h后取出，并于60 ℃的條件干燥至恒質量M2，根據式(1)得出復合膜的水溶性(W)[17]。

(1)

1.3.1.3 溶脹度測試

將復合抗菌膜裁剪成2 cm×2 cm大小的正方形，稱質量m1，將其置于50 mL的蒸餾水中，靜置5 h，取出復合膜用濾紙吸干表面的水分，稱質量m2。根據式(2)進行計算溶脹度(S)[18]。

(2)

1.3.1.4 機械性能測試

實驗采用ASTM D882-09的標準方法結合電子拉力機對復合膜的機械性能進行測定[19]，將膜制成2 mm×100 mm的樣品，初始夾距為50 cm，上升速度為25 mm/min。

抗拉強度(TS)=

(3)

斷裂伸長裂伸(EA)=

(4)

1.3.1.5 透氧性能測試

參考GB/T 1038—2000壓差法對復合膜進行測試[20]。

1.3.1.6 透濕量的測試

將復合膜裁剪成直徑為100 mm的圓形，參考GB/T 16928—1997[21]中的方法對膜的透濕量進行測定。

1.3.1.7 透光率及霧度測試

將復合膜裁剪成50 mm×50 mm的正方形，用夾具固定，根據GB/T 2410—2008[22]對其進行測試。

1.3.1.8 光澤度測試

選取入射角度為75°的光澤度測試儀，根據GB/T 8941—2007進行測試，標準板進行標定處理差值在1.2 Gs之內即可[23]。

1.3.1.9 色差測試[24]

利用色差儀對復合膜的顏色進行測定，L*為亮度，a*為發紅度，b*為發黃度，ΔE為總色差，其中標準版中L*=94.30、a*=0.31、b*0.32。根據式(5)進行計算。

(5)

1.3.2 復合膜抑菌功能的研究1.3.2.1 抑制真菌實驗

取保存好的黑曲霉菌種和根酶菌菌種，利用PDA固體培養基進行活化3代，用0.9%NaCl溶液將菌落濃度稀釋至106cfu/g，并接種于PDA固體培養基上。將復合抗菌膜裁剪為6 mm的圓形，置于培養基中間，于28 ℃的條件下培養48 h，利用游標卡尺對抑菌圈直徑進行測量。

1.3.2.2 抑制細菌實驗

取保存好的金黃色葡萄球菌菌種和大腸桿菌菌種，利用LB肉湯培養基進行活化3代，同上將其稀釋至106cfu/g，取1 mL菌液于100 mL肉湯培養基中。將復合抗菌膜裁剪為2 cm×2 cm的形狀，浸沒于培養基中，在37 ℃的條件下培養，分別在0、4、6、8、10、12、24 h時刻吸取培養液，在波長為600 nm對其吸光度值進行測定，通過吸光度的大小來表示細菌菌落數量，兩者成正相關[25]。

1.4 復合膜的保鮮研究

分別將Ze-CA膜、Ze-AG膜、Ze-CA/AG膜制備成18 cm×25 cm的袋子，將100 g無籽葡萄裝入其中，用雙面膠進行封口處理，每粒葡萄保留根部，并設置空白組(CK)進對照，將葡萄置于20 ℃的條件下儲藏，每隔1 d進行取樣。

1.4.1 失重率的測定

失重率的測定采用式(6)進行計算[26]。

(6)

1.4.2 硬度的測定

利用 GY-4 型果實硬度計對果實的正反兩面進行測定，取平均值[27]。

1.4.3 可溶性固形物含量的測定(SSC)的測定

將果實中部果肉榨汁過濾，將汁液置于阿貝折射儀上對SSC進行測定[28]。

1.4.4 可滴定酸含量的測定(TAC)

參照GB/T 12456—2008對水果的可滴定酸含量進行測定[29]。

1.5 數據處理

利用SPSS 20.0軟件結合Duncan計算方法進行數據分析，P<0.05表示差異顯著。所有指標均測量3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 復合抗菌膜的性能表征分析

2.1.1 厚度分析

如圖1所示，不同種復合抗菌膜的厚度值存在顯著性差異(P<0.05)，可能是由于AG分子與Zein分子復合較好且CA分子與AG分子存在排斥現象，使其所有分子不能均勻分布在一個平面，進而導致Ze-CA/AG膜厚度最大，而Ze-AG膜厚度最小。

注：柱形圖上的字母表示不同復合膜之間的差異性，字母相同表示差異不顯著，字母不同表示差異顯著，下同。圖1 不同種復合抗菌膜的厚度

2.1.2 水溶性及溶脹度分析

水溶性和溶脹度是包裝材料的重要性質，是反應包裝材料遇到水分子后的表現制指標，水溶性可以用于衡量復合膜是否有利于降解，溶脹度可以體現對水分子的控制能力[30]。由圖2可知，不同種復合抗菌膜的水溶性存在顯著性差異(P<0.05)，Ze-AG的水溶性及溶脹度最低，說明該膜的內部分子結構緊密，分子間作用力強，水分子對其影響較小，相反水分子對Ze-CA膜的影響較大[31]。王鍵等[32]在水浴為80 ℃的條件下，利用80%乙醇對玉米醇溶蛋白、甘油、檸檬酸進行溶解得到的復合膜表面光滑、柔軟，水溶性達到24.6%，實驗制備的Ze-AG膜的水溶性與其接近。

圖2 不同種復合抗菌膜的水溶性及溶脹度

2.1.3 機械性能分析

復合膜的機械性能對于其應用領域極為重要，抗拉強度和斷裂伸長率在一定程度上呈反比關系，復合膜的厚度對于機械性能也有一定的影響，在一定的厚度范圍內，厚度越大機械強度越大[33]。實驗制備的Ze-AG膜與其他復合膜相比較具有較強的抗拉強度，其抗拉強度為(7.12±0.91)MPa，主要因為Ze-AG膜分子間氫鍵、離子鍵、二硫鍵的相互作用力大[11]。不同復合抗菌膜的抗拉強度和斷裂伸長率均存在顯著性差異(P<0.05)。劉校男等[34]利用料液比為1∶10的Zein和80%乙醇，甘油質量為Zein的20%制備的復合抗菌膜的拉伸強度為7.6 MPa，試驗制備的Ze-AG抗拉強度與其較為一致。

圖3 不同種復合抗菌膜的機械性能

2.1.4 透氧及透濕分析

透氧系數的大小與復合膜的透氣性能成正比，透氧能力也是食品包裝中最重要的參數之一，主要由于食品中存在的氧通常與氧化現象有關[35]。根據透氧系數可以設定被包裝食品的周圍氣體環境，使其達到最適的氣體濃度。由圖4可知不同復合抗菌膜的透氧系數存在顯著性差異(P<0.05)，Ze-CA膜的透氧系數最大，說明分子間的“孔隙”較大，而Ze-AG膜分子間的“孔隙”較小，進一步表明Ze-AG膜分子間的作用力大。對氧氣的阻隔性較強。根據上述的溶脹度結果可知，復合膜具有較強的持水性能，因此采用減重法對復合膜的透濕量進行測定，大部分的水都被復合膜所吸收，只有極少數的水分透過復合膜，因此3種復合抗菌膜的透濕量不存在顯著性差異(P>0.05)。

圖4 不同種復合抗菌膜的透氧系數及透濕量

表1 不同復合膜的光學性能分析

2.1.5 光學性能分析

包裝材料的顏色是食品包裝中的關鍵參數，直接影響消費者對產品的接受程度。由表1可知，Ze-AG膜的亮度要明顯優于其他2組，主要是由于Ze-AG膜的分子間各組分融合度較好，排列較為均勻、緊密，并且光澤度也高達(52.80±2.17)Gs，從而進一步證明了Ze-AG膜的機械性能高于其他組別的原因。因為Zein中含有一定的玉米黃素，導致主體顏色為黃色，并且在成膜基材中所占比較大，所以復合膜的總體顏色呈現出黃色。一般情況下，包裝材料的透光率和霧度成反比關系，Ze-AG膜的透光率為(25.40±1.00)%，而馬中蘇等[36]制備的肉桂醛-濃縮乳清蛋白-殼聚糖復合抗菌膜的透光率為(57.66%±0.03)%，導致這一現象的原因是由于復合膜的整體顏色所引起的，因此在今后的研究中需要對復合膜進行脫色處理。

2.2 復合膜的抑菌性分析

食品的腐敗變質主要是微生物導致的，因此在食品的流通過程中對微生物的控制極為重要。試驗制備的復合抗菌膜能有效地抑制微生物的滋生，如圖5～圖7所示。Ze-CA/AG膜對真菌的抑制效果要明顯優于其他處理組，主要由于Ze-CA/AG膜分子對于抗菌劑分子的作用力小，抗拉強度低，使其很容易被“釋放”出來，進而實現對微生物的抑制，其中對黑曲霉和根霉的抑菌直徑為(35.155±0.85)、(23.17±0.94)mm，同時Ze-CA/AG膜對細菌的抑制效果也較高。彭新玲[37]制備的負載納他霉素的玉米醇溶蛋白/酪蛋白納米復合膜能有效地抑制黑曲霉的滋生。孫海濤[38]制備的玉米磷酸酯淀粉/秸稈納米纖維素/聚乙二醇膜/Nisin/ε-聚賴氨酸復合膜能有效地抑制大腸桿菌的滋生。這與本試驗制備的復合抗菌膜的抑菌性一致。

圖5 不同復合抗菌膜的抗真菌圈直徑

圖6 不同復合抗菌膜對大腸桿菌的抑制效果

圖7 不同復合抗菌膜對金黃色葡萄球菌的抑制效果

2.3 復合抗菌膜的保鮮效果分析

2.3.1 不同復合抗菌膜對葡萄失重率的影響

葡萄失重率是衡量葡萄品質的重要指標，同時水分也是影響葡萄口感的重要因素。由圖8可知，葡萄失重率隨著儲藏時間的延長逐漸增大，對于減緩葡萄失重率的增加復合膜組要明顯優于空白組，并且在保鮮期內失水率Ze-CA/AG膜組

圖8 不同復合抗菌膜對葡萄失重率的影響

2.3.2 不同復合抗菌膜對葡萄硬度的影響

葡萄果實的硬度可以直接影響到消費者的需求，同時也在其流通過程中，對其品質的評價提供了重要的參考依據。由圖9可知，在儲藏第6天時Ze-CA/AG膜組的果實硬度最大為(6.52±0.21)kg/cm2，而其他實驗組在控制果實硬度下降也要好于空白組，硬度值的降低比例較小。原因可能是復合膜可以抑制葡萄的呼吸作用，減緩了葡萄果實中呼吸作用底物有機酸的消耗[40]。

圖9 不同復合抗菌膜對葡萄硬度的影響

2.3.3 不同復合抗菌膜對葡萄可溶性固形物含量的影響

SSC是指溶容性糖類物質或其他可溶性物質，其含量的高低可以評價果實的品質。由圖10可知，隨著水分的流失及果實的進一步成熟，SSC含量會存在小幅度的上升而后開始下降。Ze-CA膜組SSC下降的比例最小為19.82%，Ze-CA/AG膜組次之為26.11%，Ze-AG膜組為29.47%，CK組最大為42.35%。復合膜能抑制葡萄果實進行無氧呼吸，減緩糖酵解途徑的發生，使干物質消耗量減少[41]。

圖10 不同復合抗菌膜對葡萄SSC的影響

2.3.4 不同復合抗菌膜對葡萄可滴定酸含量的影響

TAC是指葡萄中的游離態的酸，是葡萄品質的重要構成性狀之一，是影響其果實風味及品質的重要因素[42]。由圖11可知，相比較CK組，復合抗菌膜能有效地減緩葡萄中TAC的降低，復合膜中的抗菌劑可以有效抑制葡萄腐敗菌的滋生，減緩組織氧化分解速度和可滴定酸的消耗。

圖11 不同復合抗菌膜對葡萄TAC的影響

3 結論

Zein具有來源廣泛、易于成膜等優良的理化性能，因此，研究采用2%的Zein，1%的甘油，0.25%的明膠，分別與1%的卡拉膠、1%的瓊脂及1%的卡拉膠/瓊脂進行共混制備復合膜，并且為了提升復合膜的保鮮效果，向成膜組分中加入了0.02%的Natamycin，0.05%的和Nisin，結果表明，實驗制備的Ze-CA膜、Ze-CA/AG膜及Ze-AG膜具有較好的機械性能、阻隔性能和光學性能等理化指標，同時還能有效地抑制黑曲霉、根霉、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的滋生，Ze-CA/AG膜的抑菌效果要好于其他2組復合膜。試驗將復合膜應用于葡萄的保鮮研究中發現，3種復合膜都能有效地減緩果實失重率的增加及硬度值、SSC、TAC的下降，有利于延長葡萄的貨架期。接下來將對玉米醇溶蛋白/多糖/天然生物抗菌劑復合膜的微觀結構及抗菌劑的遷移機制進行進一步研究。