高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜聯用技術測定高脂作物中的硒形態

王鐵良， 周曉華， 劉進璽， 魏 紅， 張 迪， 郭 潔， 賈 斌， 李慧展， 楊軍勇

(河南省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所1，鄭州 450002) (農業部農產品質量安全風險評估實驗室(鄭州)2，鄭州 450002) (河南省糧食質量安全與檢測重點實驗室3，鄭州 450002) (河南省科學器材供應中心4，鄭州 450002)

硒是人體必需的微量元素，具有清除體內自由基、高抗氧化作用，可以有效地抵御病變，增強免疫力，適當補硒對一些由硒匱乏引起的疾病有一定的改善作用[1-6]。人們常通過硒營養強化劑、硒片、富硒食物等補硒，其中富硒食物因為便捷而得到了廣泛的應用，因此，富硒大米[7，8]、富硒小麥[9]、富硒香菇[10，11]、富硒靈芝[12]、富硒大豆[13]、富硒豬肉[14]、富硒雞蛋[15]、富硒大豆[16]、富硒甘薯[17]、富硒瓜菜[18]等富硒食品的生產及研究日益成為焦點，不斷地受到人們的推崇。

目前，絕大多數食品標簽、證書及一些食品標準中所涉及到的硒含量均為總硒含量，而食品中的硒包括了無機硒和有機硒，長期食用含無機硒的食物，可能會引發一些疾病[19]；而小分子的有機硒，諸如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等則更有益于人體吸收。因此，面對市場上參差不齊的富硒產品，需要對其進行硒元素形態分析來了解并對富硒食品進行一定的規范。

我國是世界上生產芝麻最多的國家之一。芝麻是一種含油率很高的優質油料作物，我國芝麻分布廣泛，食用率高；花生是一種營養價值高，利用途徑多且富硒能力較強的作物，是中國重要的油料作物和經濟作物，食用范圍比較廣；核桃營養價值豐富，有“萬歲子”“長壽果”“養生之寶”的美譽，核桃中86%的脂肪是不飽和脂肪酸，有很大的食用價值。因此，諸如此類高脂作物，營養美味，更適宜人們補硒。本文主要是優化建立一種富硒高脂作物中硒形態的提取方法，了解市場上芝麻、花生、核桃等富硒高脂作物中存在的硒形態。李娟等[20]、張卓等[21]主要研究的花生中的賦存形態為蛋白態、多糖態及脂肪態，鮮有涉及硒代氨基酸等小分子形態。因此，本文可為高脂類作物的硒形態提取提供依據，并為市場上此類富硒食品的規范提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硒代半胱氨酸(99%純度)；磷酸氫二銨、硼氫化鉀、氫氧化鉀，碘化鉀、四丁基溴化銨(優級純)；鏈酶蛋白酶；脂肪酶；三(羥甲基)氨基甲烷Tris(分析純)；亞硒酸根、硒酸根、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸標準溶液；甲醇、乙腈(色譜純)；鹽酸、硝酸(優級純)；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

SA-50液相色譜-原子熒光光譜聯用儀，Milli-Q Syhthesis超純水系統，超聲儀，離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱：Agela MP-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：30 mmol/L (NH4)2HPO4+0.5 mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇(甲酸調節pH=6.0)；流速：1.0 mL/min；進樣量：100 μL。

氫化物發生參數：載流：10% HCl；還原劑：0.35% KOH+2% KBH4+0.1% KI；紫外消解。

原子熒光參數：元素燈：硒空心陰極燈；負高壓：300 V；燈電流：90/45 mA；載氣：300 mL/min；屏蔽氣：600 mL/min。

1.3.2 標準溶液配制

分別取亞硒酸根[Se(IV)]、硒酸根[Se(VI)]、硒代半胱氨酸(Secys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMecys)、硒代蛋氨酸(Se-Met)等配制成濃度為1.00 mg/L的混合標準溶液中間液，再用中間液配制標準曲線。

1.3.3 樣品前處理

將富硒花生、核桃、芝麻試樣粉碎均勻，取適量樣品按照NY/T 1285—2007對樣品進行脫脂處理。

將富硒花生、核桃、芝麻試樣粉碎均勻，取適量樣品按照GB 5009.93—2017對樣品進行總硒測定。

稱取脫脂后的樣品0.1 g放入離心管中，加入6 mL 130 mmol/L的TRIS-HCl緩沖液(pH=7.5),振蕩混勻，加入15 mg鏈酶蛋白酶后混勻，37 ℃超聲振蕩30 min，10 000 r/min高速離心機離心10 min，上清液過0.22 μm有機濾膜后上機。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

本研究比較了用Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm,10 μm)陰離子交換柱和Agela MP-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)反相C18柱來進行分析比對。實驗中采用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱，使用檸檬酸流動相時不能完全基線分離[22]；使用磷酸氫二胺流動相時，無論等度還是梯度，分離時間均未低于15 min，且未完全基線分離，分離色譜圖如圖1所示。采用C18柱時，等度洗脫條件下可以在10 min內實現5種硒形態的完全基線分離，分離效果明顯強于使用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱。因此采用反相C18柱來進實驗分離，分離色譜圖如圖2所示。

注：1 硒代半胱氨酸；2 硒甲基硒代半胱氨酸；3 亞硒酸根；4 硒代蛋氨酸；5 硒酸根，濃度均為80 μg/L。圖1 5種硒形態標準溶液在梯度a、等度b條件下的色譜圖

注：1 硒代半胱氨酸；2 硒甲基硒代半胱氨酸；3 亞硒酸根；4 硒代蛋氨酸；5 硒酸根。質量濃度均為80 μg/L。圖2 5種硒形態標準溶液色譜圖質量

2.2 高脂作物樣品中硒形態提取方法的優化

2.2.1 樣品形態及酶種類的選擇

本研究以富硒花生Sample1(總硒測定結果為1.24 mg/kg)為實驗樣品。稱取該富硒花生鮮樣6份，每份0.2 g，雙平行，加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶+15 mg脂肪酶、15 mg脂肪酶、15 mg鏈酶蛋白酶，分別命名為X-1，X-2，X-3；再稱取該富硒花生脫脂后樣品6份，每份0.1 g，雙平行，加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶+15 mg脂肪酶、15 mg脂肪酶、15 mg鏈酶蛋白酶，分別命名為T-1、T-2、T-3。6組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機離心10 min，鮮樣上清液先過C18小柱，再過0.22 μm有機濾膜后上機，脫脂樣直接過0.22 μm有機濾膜后上機。

結果發現只加了脂肪酶的X-2與T-2均未出峰，而其余4組出峰均為硒代蛋氨酸，且X-1與X-3峰面積基本一致，T-1與T-3峰面積基本一致，同時T-3峰面積比X-3峰面積略大。選擇使用脫脂后的樣品進行實驗，無需過C18小柱，無需加脂肪酶，方便簡潔。

2.2.2 提取劑種類的選擇

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL 10% HCL、10% HNO3、130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)、0.1 mol/L KOH、超純水、20%甲醇/水、20% 乙腈/水，分別加入鏈酶蛋白酶15 mg和均不加入任何酶，各一式兩份，14組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機離心10 min，過0.22 μm有機濾膜后上機。

實驗發現，加鏈酶蛋白酶的樣品在同等條件下提取到的硒代蛋氨酸均略高于不加酶的，另外發現加10%HCl、10% HNO3、0.1 mol/L KOH、20%甲醇/水、20% 乙腈/水這5組的都只能提取到少量的硒代蛋氨酸，而加130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)和超純水均能提取到很高的硒代蛋氨酸，且加130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)提取劑的提取效率最高，因此采用130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)作為提取劑。

2.2.3 優化Tris-HCL緩沖液的濃度

配制Tris-HCL濃度分別為10、30、50、70、90、110、130、150、170、190 mmol/L ，調節pH=7.5。

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL不同濃度Tris-HCL緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，10組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機離心10 min，過0.22 μm有機濾膜后上機，結果如圖3所示，在Tris-HCL緩沖液濃度達到130 mmol/L時，硒代蛋氨酸含量達到峰值，隨著濃度繼續增加，硒代蛋氨酸的含量并未增加，因此，選擇130 mmol/L Tris-HCL緩沖液作為提取劑。

圖3 不同Tris-HCL濃度下硒代蛋氨酸的含量

2.2.4 優化Tris-HCL緩沖液的pH

配制130 mmol/L Tris-HCL緩沖液，分成6份，分別調節pH為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0。

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL上述不同pH的130 mmol/L Tris-HCL緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，6組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機離心10 min，過0.22 μm有機濾膜后上機，結果如圖4所示，當Tris-HCL緩沖液的pH=7.5時，提取到的硒代蛋氨酸含量達到了最大值，因此采用pH=7.5的130 mmol/L Tris-HCL緩沖液提取。

圖4 不同Tris-HCL pH、鏈酶蛋白酶添加量、提取體積、提取時間下硒代蛋氨酸的含量

2.2.5 優化鏈酶蛋白酶的用量

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)緩沖液，振蕩混勻，再分別加入5、10、15、20、25、30 mg鏈酶蛋白酶，6組樣品于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機離心10 min，過0.22 μm有機濾膜后上機，結果如圖4所示，加酶量到15 mg后，隨著酶量的增加，提取到的硒代蛋氨酸含量變化很小，因此，考慮到價格因素，將采用15 mg加酶量進行實驗。

2.2.6 優化提取劑Tris-HCL緩沖液的用量

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入2、4、6、8、10 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，于37 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后用10 000 r/min高速離心機離心10 min，過0.22 μm有機濾膜后上機，結果如圖4所示，提取體積為6 mL時，提取到的硒代蛋氨酸含量最高。

2.2.7 優化提取時間

稱取脫脂后樣品0.1 g，分別加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)緩沖液，振蕩混勻，再分別加入15 mg鏈酶蛋白酶，5組樣品于37 ℃下分別超聲振蕩提取10、20、30、40、60 min后離心，過0.22 μm有機濾膜后上機，結果如圖4所示，超聲時間達到30 min時，已經達到很高的提取效果，且隨著時間增加，提取效率并未明顯提高，因此，采用30 min作為最終提取時間。

2.3 標準曲線及檢出限

配制10、20、40、60、80、100 μg/L系列混合標準溶液，上機檢測。其保留時間、線性方程、相關系數及檢出限見表1。結果顯示該線性方程的線性相關系數r均≥0.999 2，檢出限均≤3.0，符合檢測需求。

表1 5種硒形態的保留時間、線性方程、相關系數和檢出限

2.4 精密度與回收率

本研究以富硒花生Sample1(總硒測定結果為1.24 mg/kg)為實驗樣品。進行精密度和回收率實驗。其結果如表2所示，5種硒形態的加標回收率在89.8%～100.6%之間，精密度RSD/%(n=7)均不超過4.0。

表2 花生中硒形態的精密度與加標回收率(n=7)

2.5 實際樣品檢測

在儀器條件最靈敏的條件下，用建立的新方法對花生、芝麻、核桃的實際樣品進行提取檢測。結果如表3所示，樣品中提取到的硒形態均為硒代蛋氨酸，且硒代蛋氨酸質量分數為88.0%～96.9%，其中，富硒花生樣品1(總硒測定結果為1.24 mg/kg)色譜圖見圖5，根據保留時間定性可知該花生中硒賦存形態為硒代蛋氨酸。由此可見，這些高脂作物中硒的主要成分為硒代蛋氨酸，同時進一步驗證了該方法較高的提取率。

表3 市售富硒花生、芝麻、核桃中硒形態含量

圖5 富硒花生樣品1中硒代蛋氨酸的色譜圖

3 結論

本研究建立了一種高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜聯用技術測定高脂作物中5種硒形態的方法，該方法可以在10 min內可以實現5種硒形態的基線分離，且便于操作、經濟綠色、提取時間短、提取效率高。目前，鮮見有含油量較高的食品硒形態的檢測，本研究可以實現對含油量比較高、提取困難的高脂作物中硒形態的測定，為富硒食品的測定提供技術支持，為市場上富硒食品的規范化提供一定的參考。