外泌體在骨髓間充質干細胞骨向分化及其在牙周再生中的研究進展

張淑婷，吳亞星，劉翠翠，李晨晨，張 靜，

牙周病是人類口腔第一高發疾病，在長期持續的炎癥刺激下，牙槽骨可發生病理性吸收，最終導致牙齒松動甚至脫落[1-2]。隨著組織工程研究的逐漸深入，干細胞在骨組織修復中的作用日益凸顯[3-4]，但體外擴增能力有限、生物學效應繁雜、主要生物功能可被生物活性分子組合所取代等局限性阻礙了其發展和應用[5-6]。近期研究發現，外泌體(exosome)能夠通過攜帶蛋白、miRNAs等分子傳遞信號，調控骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)等成骨相關細胞的增殖、分化，影響骨組織生成和吸收過程。本文就外泌體在BMSCs骨向分化中的研究作一綜述，為外泌體在臨床骨缺損中的應用提供依據。

1 外泌體的生物學特征

外泌體是一種來源于多種細胞的細胞外囊泡[7]，不同細胞衍生的外泌體可通過核酸、蛋白質和脂質等生物分子傳遞信號[8]，介導細胞間的信息交流，促進血管生成和調控免疫炎癥反應[9-10]。外泌體存在于生物體的各種體液中，可通過循環系統在全身傳播，并通過血腦屏障和其他組織被靶細胞吸收。外泌體可通過3種方式傳遞信號：受體-配體結合、膜融合或吞噬作用。目前多種類型細胞已被證實能產生并分泌外泌體到細胞外環境中，通過細胞間的相互作用影響局部微環境并調節細胞的生理功能。外泌體特性與其來源的細胞有關，不同細胞來源的外泌體通過不同的分子傳遞信號，調控目標細胞的發育、增殖及免疫能力。

2 不同來源外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

2.1 調節性T細胞(Treg)外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

Treg細胞是T細胞中一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，能夠維持體內免疫系統的穩定性并調控炎癥反應，是重要的免疫調節功能細胞[11-12]。Treg細胞在2013年才首次被證實具有釋放外泌體參與免疫調節的作用[13]，外泌體是Treg細胞發揮生物功能不可或缺的組成部分，CD8+Treg細胞活化后釋放外泌體表達抗炎介質抑制樹突狀細胞引發的免疫反應，以及表達FasL發揮細胞凋亡作用，抑制機體免疫反應[14]。Tregs介導的抗炎微環境能促進骨再生，通過抑制IFN-γ和TNF-α的分泌，提高BMSCs介導的骨形成[15]。另一項研究證明，Treg細胞來源的外泌體過表達miR-142-3p，顯著促進BMSCs成骨分化和血管生成。miR-142-3p還可通過抑制TGFBR1/SMAD2促進成骨分化[16]。

2.2 巨噬細胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

巨噬細胞在先天免疫反應和成骨功能中發揮著關鍵作用。在急性炎癥時，巨噬細胞可將炎癥細胞聚集到受損部位后清除損傷組織，同時釋放抗炎信號介導骨再生。巨噬細胞有M1型(促炎表型)和 M2型(抗炎表型)。急性炎癥期，M1型巨噬細胞表達活躍，隨后巨噬細胞可分化為M2型巨噬細胞，并釋放相關因子促進成骨，如骨形態發生蛋白2等[17-18]。研究表明，用鈦顆粒刺激巨噬細胞，TNF-α等促炎因子表達明顯上調，流式細胞術檢查鈦顆粒刺激的正常和轉染巨噬細胞，均觀察到巨噬細胞向M1型極化[19]。研究發現miR-5106在M2型巨噬細胞來源的外泌體(M2D-Exos)中顯著過表達，而在M1型巨噬細胞來源的外泌體(M1D-Exos)中表達下降。這種外泌體miRNA可以直接靶向鹽誘導激酶2和3(SIK2和SIK3)誘導BMSCs成骨分化[20]。SIK2/SIK3過表達時，可在BMSCs中檢測到成骨基因水平降低。miR-5106過表達導致SIK2和SIK3的表達明顯受到抑制，可挽救SIK2/SIK3對成骨分化造成的部分負面影響。另一項研究報告稱，高糖高胰島素對BMSCs成骨分化潛能有抑制作用。干預 M2型巨噬細胞來源的外泌體后，BMSCs中的Hedgehog信號通路被激活，成骨分化潛能增強[21]。

2.3 BMSCs外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

BMSCs外泌體含有三種成骨相關miRNA：miR-196a、miR-27a和miR-206，其中miR-196a是最重要的外源性成骨調節因子。此外，血管再生在骨修復中的也起著至關重要的作用。BMSCs衍生的外泌體能夠增加體外內皮細胞的活力，并刺激體內血管生成。BMSCs衍生的外泌體過表達miR-26a-5p，可在體外延緩滑膜成纖維細胞的損傷，并在體內減輕骨關節炎損傷[22]。研究發現，BMSCs衍生的外泌體過表達糖蛋白非黑色素瘤克隆B(GPNMB)能有效促進大鼠BMSCs的增殖和成骨分化，減輕卵巢切除誘導的骨丟失，可能的機制是激活Wnt/β-catenin信號通路[23]。另一項研究報告稱，將BMSCs衍生的外泌體可逆地固定在三維多孔聚醚醚酮(PEEK)表面上，結果顯示在Exo-TA-SPEEK上培養的BMSCs表現出更好的增殖和黏附能力。負載外泌體的聚醚醚酮可通過NF-κB途徑調節巨噬細胞極化，Exo-TA-SPEEK提供了更有利的骨免疫微環境，有利于BMSCs的進一步成骨分化。此外，研究結果表明Exo涂層的PEEK可促進BMSCs的直接成骨分化[24]。

2.4 成骨細胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

成骨細胞來源外泌體內蛋白質和RNA可發出信號，觸發靶細胞應答，促進細胞間信息交流[25]。研究表明成骨細胞在分化中晚期釋放的外泌體可顯著促進去卵巢小鼠BMSCs成骨分化，改善骨質疏松；結果還表明，外泌體對成骨的影響與基質囊泡的成熟有關，只有中晚期的外泌體具有成骨誘導作用，中期的外泌體經人工軟骨淋巴處理可促進基質囊泡的成熟，但對成骨誘導作用無影響[26]。此外，來自礦化成骨細胞的外泌體可促進BMSCs分化為成骨細胞[27]。礦化成骨細胞來源的外泌體可激活Wnt信號促進BMSCs的骨向分化。在受體細胞中，通過激活下游信號通路，尤其是Wnt信號、胰島素信號、TGF信號和鈣信號參與成骨。但成骨細胞來源的外泌體也可導致骨丟失[28]，通過RANKL促進破骨細胞的形成。此外，miR-214可抑制PTEN表達，同時激活PI3K/Akt信號通路來促進破骨細胞的形成。

2.5 破骨細胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

除骨吸收外，破骨細胞也能夠促進血管生成、調節成骨細胞的活性。破骨細胞來源的外泌體還可通過miR-324靶向arhgap1(骨分化的負調控因子)[29]，在體外可顯著誘導BMSCs的成骨分化和礦化，且富含miR-324的外泌體修飾支架在小鼠顱骨缺損模型中表現出較高的成骨能力。有學者發現核因子受體激活劑RANK在破骨細胞釋放的外泌體中高度表達，是破骨細胞發生旁分泌的調節因子，RANK負載的破骨細胞衍生囊泡結合成骨細胞RANKL，并通過RANKL反向信號促進骨形成[30]。此外，來自成熟破骨細胞的外泌體可以通過旁分泌機制抑制破骨細胞的形成。破骨細胞衍生的外泌體在炎癥性骨病中可防止過度骨溶解。類風濕性關節炎患者血漿中的外泌體與正常人血漿中的外泌體相似，能夠抑制破骨細胞的產生[22]，可能是由于成熟破骨細胞衍生的外泌體中受體RANK可作為誘餌受體，競爭性結合RANKL，與骨保護素作用類似。

2.6 脂肪干細胞外泌體在BMSCs骨向分化中的作用

脂肪干細胞(adipose stem cells，ASCs)方便且易于獲取，近來逐漸進入人們視野。研究表明ASCs表現出與BMSCs類似的生物學能力[31]。ASCs衍生的外泌體可通過抑制促炎介質TNF-α、IL-6、PGE2、NO的產生和增加抗炎因子的表達水平，促進間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的骨形成。研究發現，ASCs來源的外泌體可通過過表達miR-375，上調具有成骨誘導的成骨相關基因(包括RUNX2、ALP、COL1A1和OCN)的mRNA表達，促進BMSCs體外成骨分化[32]。

另一項研究表明，將ASCs衍生的外泌體固定在聚多巴胺涂層的聚乳酸-co -乙醇酸(PLGA/pDA)支架上，外泌體可從PLGA/pDA支架中緩慢且持續地釋放出來，增強BMSCs的體外遷移能力[33]。此外，負載ASCs外泌體的Mg-GA支架，可穩定骨移植環境，保證血液供應，促進BMSCs成骨分化[34]。

3 外泌體在牙周炎中的作用

牙周病導致的牙周組織破壞與致病菌引起的免疫炎癥反應有關[35]，牙周炎中的多種炎癥因子可導致進行性骨溶解，抑制骨形成。在炎癥過程中，各種細胞釋放的外泌體可同時抑制炎癥反應[36]，這可能是機體的自我保護作用。然而，這種抗炎作用并不能完全阻止牙周炎的進展。即使清除牙周病原體，牙周炎所導致的牙槽骨吸收也難以恢復，改善牙周附著水平是一個重要的治療目標[37]。近年來，外泌體在牙周再生中的應用潛力已得到證實。外泌體在牙周炎的治療中有3個主要途徑：調節免疫反應、抑制骨吸收和啟動骨修復。研究表明BMSCs能夠促進牙周再生，BMSCs來源外泌體可通過增加牙周膜(PDL)細胞的遷移和增殖來促進牙周再生，是一種可行的治療牙周組織缺損方法。研究證實BMSCs外泌體可通過腺苷受體介導的AKT和ERK信號通路激活增強PDL細胞遷移和增殖，其與膠原海綿聯合使用能夠在大鼠牙周組織缺損模型中促進牙周組織再生，且不會引起任何不良反應[38]。

另一項研究發現ASCs來源的外泌體對牙周炎的治療效果優于ASCs本身。ASCs來源的外泌體可促進牙周組織的再生，為牙周治療提供新的參考。此外，牙齦間充質干細胞(GMSC)衍生的外泌體可促進M1型巨噬細胞向M2型極化，抑制炎癥反應，可能為巨噬細胞參與牙周炎治療提供了一種可能方法[39]。

4 總 結

外泌體在治療骨缺損方面具有巨大的應用潛力，局部微環境中的Treg細胞、BMSCs、成骨細胞和巨噬細胞等不同來源的外泌體均可參與調節骨修復。與臨床使用的常規療法相比，外泌體具有良好的穩定性、可操作性和廣泛的來源，因此應用前景十分廣闊。然而，其系統機制尚未被有效解釋，不同劑量的外泌體對骨再生修復可產生不同的影響，相關研究有待進一步深入。由于體內和體外以及生物體之間的差異，外泌體在牙周炎中的作用也需進一步的研究來確認其療效。不同細胞衍生的外泌體可通過各種途徑和信號調節炎癥反應，促進BMSCs成骨分化和牙周組織再生，為牙周炎導致骨缺損的治療提供參考。