板栗組織培養(yǎng)及褐變研究

□文/李婧實 周麗艷 睢金凱 程曉園

板栗原產(chǎn)地是在中國，是世界上非常受歡迎的干果之一。板栗果實營養(yǎng)豐富，風味獨特。常見的板栗產(chǎn)品有烤板栗、速凍板栗粒、板栗罐頭、板栗汁、板栗飲料等，深受市場消費者的喜愛。

一、板栗的營養(yǎng)和藥用價值

板栗富含人體所需的營養(yǎng)素和微量元素。新鮮板栗果實的碳水化合物含量遠遠高于其他同類產(chǎn)品，因此可以替代基本食物，為人體提供熱量。栗子也富含蛋白質(zhì)。板栗和板栗皮的脂肪含量普遍，但大部分為不飽和脂肪酸。板栗中的微量元素含量也高于普通水果，尤其是鐵、鋅和鉀。板栗具有很高的藥用價值。板栗中所含的微量元素對預防骨質(zhì)疏松有很好的作用。不飽和脂肪酸在對血脂進行調(diào)節(jié)、減少血栓形成、預防心血管疾病方面發(fā)揮著積極作用。根據(jù)中醫(yī)的食物同源理論，常吃栗子可以強筋健腎，其效果與人參、當歸相當［1］。

二、板栗組織培養(yǎng)

近年來，板栗品種的選育也有了極大的改善，優(yōu)良栗子的供應迫在眉睫。通過運用組織培養(yǎng)技術能夠有效地解決這些技術問題，但其效果還有一定的不足。以燕山低日紅板栗種子為例，誘導異種分枝，生根率為53.7%，進行體外覆蓋。目前，還沒有直接利用莖尖、腋芽、樹干和葉片等營養(yǎng)器官作為解釋性再生系統(tǒng)，進行板栗的扦插以及組織培養(yǎng)時，生根比較困難，其根源尚不清楚。一些人認為栗子幼苗或小枝中的過量現(xiàn)象是導致抑制根系生長緩慢的重要原因，但還缺少一定的數(shù)據(jù)支持［2］。與其他果樹進行對比，板栗組織培養(yǎng)的研究相對落后，這也讓板栗基因工程的研究存在很大的困難。美國、歐洲、日本等國運用板栗的腋生繁殖，進行無根播種，能夠有效地降低發(fā)病率。我國對板栗栽培技術的研究較少。以往的實驗結果表明，板栗再生系統(tǒng)中的形態(tài)發(fā)生結合是限制板栗組織培養(yǎng)快速增殖的主要因素。組織無法區(qū)分外來分枝，增殖的無根幼苗生根的困難性比較大，同時在體細胞胚發(fā)育的過程中，很難區(qū)分細胞極性。因此，為了能夠促進板栗形成快速繁殖體系以及再生體系，不僅需要對板栗離體培養(yǎng)的技術進行研究，還需要不斷的探索板栗離體生長的調(diào)控機制，更好的推動板栗離體生長，有效提升板栗的組織培養(yǎng)水平［3］。

三、板栗組織培養(yǎng)中的褐變問題

在板栗組織培養(yǎng)中，褐變會引起外植體的反分化或再分化，從外植體表面釋放棕色物質(zhì)到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基逐漸變褐，外植體進一步褐變死亡。外植體通常是指從板栗切下的組織或切片，用于創(chuàng)建、生長或進行克隆板栗的組織培養(yǎng)。當傳代培養(yǎng)時，培養(yǎng)的組織片段在轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基時被稱為外植體。褐變在板栗組織培養(yǎng)過程中是經(jīng)常會發(fā)生的情況，褐變、真菌污染和水分過多（即玻璃化）被認為是板栗組織培養(yǎng)中的三大問題。因為控制褐變比控制污染和水分過剩更難，有效控制褐變也是進行板栗組織培養(yǎng)成功的秘訣。褐變一般是在外植體中出現(xiàn)，常發(fā)生在板栗愈傷組織傳代、懸浮細胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的過程中，褐變會對外植體、細胞、培養(yǎng)基以及多種酶、培養(yǎng)物的生長和分化有抑制作用，甚至死亡。

四、板栗組織培養(yǎng)發(fā)生褐變的原因

褐變主要可以劃分為酶促褐變以及非酶促褐變，在板栗組織培養(yǎng)中，褐變主要是由酶的引起。酶促褐變需要滿足三個條件：酶、基質(zhì)和氧。引起褐變的酶主要有多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）和苯胺氨酶（PAL），其中比較重要的是PPO酶，也是引起褐變的主要因素。引起褐變的酶基質(zhì)主要由酚組成，在正常發(fā)育的植物組織中，基質(zhì)、氧和PPO的存在不會引起褐變。這是因為在普通組織細胞中，多酚在細胞液泡中很常見，PPO在每個細胞中都很常見。在種子或細胞組織中，由于這樣的區(qū)域分布，PPO不能進入基質(zhì)，當細胞膜結構發(fā)生變化和破壞時，創(chuàng)造酶和PPO接觸的條件，在有氧的情況下，酚被氧化為醌，發(fā)生了一系列脫水和聚合物反應。最終形成了一種深棕色物質(zhì)，發(fā)生了褐變現(xiàn)象。

五、克服板栗褐變的措施

1.選擇合適的板栗培養(yǎng)條件

對外植體進行合理的選擇，構建最佳的培養(yǎng)環(huán)境，也是阻止板栗發(fā)生褐變的重要方式。外植體的褐變程度隨時間和年齡的不同而不同，成年的樹木褐變程度較苗木嚴重，夏季材料褐變程度較冬、早春、秋季嚴重。介質(zhì)的選擇性也必須適當，注意介質(zhì)的狀態(tài)類型，培養(yǎng)基的組成，如礦物鹽、蔗糖濃度、激素水平和組合也應適當。

2.添加褐變抑制劑和吸附劑

在組織制備過程中，通常在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和吸附劑，以對抗酶對外植體的影響。在培養(yǎng)基中通過添加抗氧化劑，能夠改變外植體周圍的環(huán)境，組織酚氧化，有效的減少褐變。現(xiàn)階段，在組織培養(yǎng)中通過能夠使用的抗氧化劑種類比較多，需要進行合理的選擇。

3.其他褐變預防措施

褐變外植體材料的連續(xù)轉(zhuǎn)移和預處理可以降低醌類對培養(yǎng)物的毒性作用。接種1～2天后，芽尖長出，將組織轉(zhuǎn)入到新培養(yǎng)基。接種12～24小時后，需要轉(zhuǎn)移到液體的培養(yǎng)基中，每天接種一次，持續(xù)1周以抑制褐變。外植體用流水沖洗干凈后，放入5℃左右的冰箱中，低溫處理12～24小時，進行滅菌，然后，先將外植體放置到含蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)7天，從培養(yǎng)基中取出外植體，使外植體中的酚類物質(zhì)部分浸潤，浸入0.1%的漂白粉溶液10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中，有效防治褐變［4］。

結語：

板栗分布在世界各地，具有很高的經(jīng)濟價值。為了充分利用板栗資源的效益，探索板栗的種植優(yōu)化，已成為板栗資源保護、開發(fā)以及可持續(xù)利用的重要研究方向。