梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法研究和應(yīng)用進(jìn)展

陳天譽(yù)

廣西賀州市皮膚病防治醫(yī)院 廣西 賀州 542899

梅毒是梅毒螺旋體（TP）感染誘發(fā)的性傳播疾病，患病后會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，個(gè)人、家庭、社會(huì)均會(huì)受到危害。當(dāng)前，臨床對(duì)梅毒的診斷需綜合對(duì)患者的病史進(jìn)行考慮，結(jié)合臨床表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室測(cè)定數(shù)據(jù)。但梅毒的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜，由于TP病原學(xué)檢測(cè)因?qū)嶒?yàn)室條件的限制，故梅毒血清學(xué)試驗(yàn)是診斷的主要依據(jù)。最近幾年，由于現(xiàn)代免疫學(xué)與分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使TP的血清免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定方式與技術(shù)獲得了不斷深化與發(fā)展。先天梅毒的診斷主要憑借實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，因測(cè)定抗體是IgG抗體，能夠由母體通過(guò)胎盤，無(wú)形中會(huì)干擾先天梅毒的診斷。在免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與完善下，諸多實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)測(cè)定方式的聯(lián)合應(yīng)用，能夠使梅毒的診斷敏感度與特異性提高。現(xiàn)就梅毒血清學(xué)測(cè)定方式展開(kāi)綜述。

1 傳統(tǒng)梅毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)

人體感染TP后，一方面宿主會(huì)對(duì)感染損傷的局部組織發(fā)生免疫應(yīng)答，出現(xiàn)非特異性心磷脂類抗體，另一方面宿主對(duì)TP外膜脂蛋白等抗原也會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗TP抗原的特異性抗體。所以，梅毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)有：非TP抗原血清學(xué)試驗(yàn)、TP抗原血清學(xué)試驗(yàn)。

1.1 非TP抗原血清學(xué)試驗(yàn) 性病研究實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)（VDRL）是美國(guó)在1946年建立，用實(shí)驗(yàn)室名命名。需用顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行讀取，當(dāng)前臨床應(yīng)用較少，主要用在檢測(cè)腦脊液標(biāo)本，能夠科學(xué)診斷梅毒。快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）應(yīng)用的抗原是特制活性炭顆粒吸附抗原，用肉眼觀察白色紙板上有黑色凝集顆粒出現(xiàn)時(shí)會(huì)影響結(jié)果判斷[1]。甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST），是用脂質(zhì)抗原經(jīng)染色和血清中抗體反應(yīng)后產(chǎn)生的紅色凝集顆粒，能夠肉眼觀察。

1.2 TP抗原血清學(xué)試驗(yàn) 梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA），是由睪丸中提取TP并純化，用Nichols株TP充當(dāng)抗原，測(cè)定血清中抗TP-IgG。由于抗原制備成本高，提純難度大，漸漸被TP-PA替換。梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA），反應(yīng)原理同TPHA，敏感性與特異性均在提高，是臨床確證試驗(yàn)的常用方式[2]。

1.3 熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS） 抗原用完整的Nichols株充當(dāng)，在待測(cè)血清中添加吸收劑，除去待測(cè)血清中可能存在的非特異抗體，加入熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白IgG，如血清中含有TP抗體會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)的熒光。當(dāng)前，該試驗(yàn)將其作為診斷梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。但操作比較復(fù)雜，需熒光顯微鏡方能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行證實(shí)，普通實(shí)驗(yàn)室尚未開(kāi)展。非TP抗原血清試驗(yàn)由于梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)診斷試劑（TRUST，國(guó)藥準(zhǔn)字：S10940058）便宜，操作便捷，敏感性高，能夠迅速對(duì)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告，常在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用，能夠作為定量實(shí)驗(yàn)，對(duì)再感染與療效進(jìn)行判斷。

2 近年來(lái)新開(kāi)展的梅毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1 TP-IgM抗體測(cè)定 人體感染TP大約2周后，先會(huì)產(chǎn)生IgM型TP抗體，4周產(chǎn)生IgG型TP抗體。特異性IgM類抗體的產(chǎn)生是感染梅毒后機(jī)體首先產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答。經(jīng)治療，IgM抗體會(huì)轉(zhuǎn)陰，再次感染會(huì)轉(zhuǎn)陽(yáng)，所以IgM是梅毒早期感染的血清學(xué)指標(biāo)[4]。最近幾年，又開(kāi)發(fā)出TP-IgM抗體的測(cè)定方法，此項(xiàng)試驗(yàn)?zāi)軌蛴迷谠缙诿范镜脑\斷，臨床療效的觀察與梅毒再次感染的判斷，對(duì)梅毒的診斷意義深遠(yuǎn)。IgM抗體分子量大，母體IgM抗體無(wú)法通過(guò)胎盤，若新生兒血清中TP-IgM為陽(yáng)性則表示已受感染[5]。另外，梅毒的診治中容易遇到僅TPPA是陽(yáng)性，RPR陰性或二者均為陽(yáng)性，但RPR滴度＜1:4的患者，特別是老年人與欲懷孕的婦女是否存在傳染性等問(wèn)題，用傳統(tǒng)的方式難以衡量，測(cè)定IgM抗體能夠提供參考價(jià)值。若此類人群的TP-IgM抗體以陰性反應(yīng)呈現(xiàn)，表示基本無(wú)傳染性。若測(cè)定血清中有TP-IgM抗體，表示患者近期有感染，具有傳染性。

2.2 TP重組抗原血清學(xué)試驗(yàn)

2.2.1 免疫印跡技術(shù)（WB）

TP-WB為上世紀(jì)末研發(fā)的聯(lián)合免疫學(xué)與分子生物學(xué)新技術(shù)，是將TP純化抗原轉(zhuǎn)移至制備的纖維膜條上，和待測(cè)血清反應(yīng)后用酶標(biāo)記抗人IgG測(cè)定，如：待測(cè)血清中存在抗TP分子量15000,17000,42000、47000特異抗原抗體時(shí)，添加酶底物/色原物質(zhì)反應(yīng)后，可于印跡上對(duì)應(yīng)的特異性多肽抗原部位產(chǎn)生色條帶[6]。這項(xiàng)試驗(yàn)一般不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，特異性較強(qiáng)，敏感度高，能夠用于測(cè)定IgM型抗體對(duì)先天梅毒進(jìn)行診斷[7]。雖然WB試劑盒價(jià)格高于其余幾種梅毒特異性抗體，但這種方法是當(dāng)前最理想的測(cè)定梅毒的方式。還有研究得出，47000抗原抗體區(qū)帶于WB測(cè)定中展現(xiàn)，能夠作為早期梅毒的診斷指標(biāo)。治療后15500與17000蛋白抗體變化顯著，作為觀察療效的指標(biāo)。

2.2.2 TP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

TP-ELISA使用純化基因重組梅毒螺旋體TP47，特異性抗原包被微孔板上，用雙抗原夾心法對(duì)TP特異性抗體進(jìn)行測(cè)定，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的TP抗原夾心法測(cè)定血清中梅毒特異性抗體，能夠?qū)P的IgG類或IgM類抗體進(jìn)行測(cè)定。TP-ELISA靈敏度、特異性與TPPA接近，能夠用在篩查與確認(rèn)試驗(yàn)中，比較適合大批量樣本檢查[8]。

3 分子生物學(xué)研究進(jìn)展

3.1 PCR方法 現(xiàn)存的基因檢測(cè)方法主要有常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR），PCR能夠直接檢查梅毒螺旋體特異性基因片段，特異性與敏感性均較強(qiáng)，對(duì)早期梅毒的測(cè)定以及對(duì)再感染和復(fù)發(fā)的判斷價(jià)值較高[9]。當(dāng)前PCR檢測(cè)TP主要的靶基因中以TP47、polA特異性較高，但存在的不足是所用儀器比較特殊，較梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)診斷試劑（TRUST，國(guó)藥準(zhǔn)字：S10940058）盒成本較高，對(duì)操作人員有較高要求，應(yīng)用存在一定局限，當(dāng)前只能充當(dāng)血清學(xué)方法的補(bǔ)充方式[10]。

3.2 基因分型系統(tǒng) TP基因分型系統(tǒng)是梅毒分子流行病學(xué)最重要的研究方法，上世紀(jì)90年代末，美國(guó)學(xué)者Pillay提出TP分型方式，將高度異質(zhì)性的酸性重復(fù)蛋白基因（arp）、梅毒螺旋體重復(fù)基因家族（tpr）充當(dāng)目的基因，對(duì)兩種基因均開(kāi)展普通PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物會(huì)由Mse I限制性酶切與瓊脂糖凝膠電泳分離后，取得的目的片段聯(lián)合即是完整的TP基因型別，對(duì)經(jīng)組織培養(yǎng)的Nichols株對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，用Simpson多樣性指數(shù)分析數(shù)據(jù)展現(xiàn)，此分型和方法比較符合一般基因分型系統(tǒng)的評(píng)判依據(jù)，數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，具有良好的可重復(fù)性，分辨率高[11]。但當(dāng)前用于分型的標(biāo)本依然來(lái)源于潰瘍性皮損，標(biāo)本多數(shù)來(lái)自男性患者，女性患者生殖器潰瘍難以發(fā)現(xiàn)，會(huì)使分型數(shù)據(jù)代表性有偏差。其二，部分標(biāo)本由于DNA含量低下，血液標(biāo)本敏感性較低，無(wú)法分型，需進(jìn)一步研究基因在分型系統(tǒng)中的穩(wěn)定性[12]。

3.3 免疫層析技術(shù)（ICA） ICA是發(fā)展成熟的體外快速診斷方法，是以基因工程生產(chǎn)的重組TP外膜蛋白是包被與標(biāo)記抗原，當(dāng)待測(cè)樣本中TPIgG/IgM在模條上標(biāo)記的特應(yīng)性抗原反應(yīng)，復(fù)合物經(jīng)模條毛細(xì)血管層析后，對(duì)顯色帶的顯色情況進(jìn)行觀察判斷是否有感染TP的存在，測(cè)定成本較低，迅速方便，適合批量大的篩查[13]。有研究用重組抗原TPN17、TPN47創(chuàng)建免疫層析方式，以FTA-ABS為準(zhǔn)，結(jié)果展現(xiàn)敏感性99.38%，特異性99.96%。還有研究用ELISA對(duì)118份樣本進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定陽(yáng)性符合率為85.20%，有一定漏檢率，存在一定假陰性，可能是因“前帶現(xiàn)象”引起，所以ICA能夠作為梅毒抗體測(cè)定的輔助性方式，用于ELISA檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果的確認(rèn)[14]。但是，ICA無(wú)法區(qū)分近期感染與已治療的梅毒，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性數(shù)據(jù)需做試驗(yàn)確定。

小結(jié)

梅毒對(duì)人體的危害甚大，甚至?xí){到生命，及時(shí)的診治十分重要。雖然檢測(cè)梅毒的技術(shù)較多，但這些診斷技術(shù)尚不夠成熟，依然處在探索階段，實(shí)驗(yàn)方式的進(jìn)展不僅要從技術(shù)上能夠提高血清學(xué)診斷敏感性、準(zhǔn)確性、特異性，特別是對(duì)滴度變化的監(jiān)測(cè)，自動(dòng)化測(cè)定系統(tǒng)能夠減少人為性錯(cuò)誤。但是，當(dāng)前尚未有一種方法能夠滿足梅毒的診斷，療效的觀察，全部的測(cè)定方法均處在特殊的范圍內(nèi)，僅用單一的梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)診斷試劑（TRUST，國(guó)藥準(zhǔn)字：S10940058）診斷局限性較大，容易漏檢。最近幾年用基因工程重組TP外膜蛋白可對(duì)抗原進(jìn)行測(cè)定，如：TPELISA與免疫層析技術(shù)在臨床應(yīng)用較廣，但TP重組抗原無(wú)法覆蓋全部的TP抗原成分，無(wú)法完全測(cè)定全部的梅毒抗原，且特異性和TPPA、FTAABS、TPHA依然有一定差異，所以對(duì)梅毒的確診需按國(guó)家制定的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。

梅毒血清學(xué)試驗(yàn)是檢查梅毒的主要依據(jù)，但不是唯一依據(jù)，醫(yī)生需在掌握患者病史的基礎(chǔ)上結(jié)合梅毒的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，將假陰性與假陽(yáng)性排除，正確做出治療與判定。由于梅毒是比較嚴(yán)重的疾病，當(dāng)前的診斷方法依然有不足之處，需進(jìn)一步完善修正。